机电设备；安全检测；质量保证；研究
1.前言
近些年来，针对煤炭行业事故不断的状况，中央和地方政府一直在下大力很抓煤矿的安全生产。由于煤矿大型机电设备（包括主通风机、提升机、水泵及空气压缩机等）的合理正常运行在矿山安全生产建设中占据着特殊位置，定期对其进行的安全性能检测检验工作就越来越显的尤为重要。通过对大型机电设备的安全性能、技术性能进行检测分析，可以迅速发现设备事故隐患，使矿方及时进行预防和整改。
生命至上，安全为天。针对煤矿机电设备的安全检测检验工作要求以满足客户需求为宗旨，以提高检测工作质量为目的。为此，工作中除了以严肃认真、尽心尽责的态度进行检测、计算和分析外，更要深入研究检测工作质量保证措施，努力实现检测结果的真实准确，从而达到为煤矿安全生产提供强有力技术支持的目的。
2.标准有效是检测工作质量保证的前提
现行有效的安全生产检测检验标准是检测工作进行的前提和依据，任何偏离标准的检测行为都存有潜在的职业风险。因此，当我们新开展一项检测检验工作的时候，首先应选择国家标准、行业标准和地方标准，其次确认标准是否先行有效，再者判断该检测方法能否满足客户需求，最后要对应标准条款要求，从实验室场地、人员素质、环境设施、检测设备等各方面入手，全面评估本实验室的资源能否满足标准方法规定的要求。经研究认为，只有当上述条件均已满足的情况下，新检测项目的工作质量才会从源头处得到保障。对于在用的检测检验标准，实验室要按照年度计划，通过互联网权威网站、专业技术机构等定期（比如半年一次）进行标准查新工作，当发现有过期标准存在时，立即停止现有的检测工作，重新履行标准变更的相关手续。
3.人员设备是检测工作质量保证的基础
任何煤矿机电设备的检测检验活动都是通过专业技术人员操作检测设备来完成的。安全检测行业的重要性和特殊性要求技术人员必须具有很高的职业道德、专业水平和工作经历，应当及时解决检测活动中的技术疑难问题，对被检对象状态迅速作出客观、综合、准确的判断。为此实验室要经常性地组织有关法律法规、岗位职责、检验标准、理论知识和操作技能的宣贯培训。技术人员只有经过考试（或考核）合格后，才可以签发操作证，持证上岗，否则不得从事检测检验工作。配备一定数量的高学历、高职称、高技能人员对检测工作质量保证也有很大好处。
如果检测设备出现问题，那它对于整个检测工作质量的影响将是致命的。因此，一台检测设备从填报购置计划开始，就要对其实施有效控制。实验室首先要收集供应商信息，并对其进行评价工作。此外，所选仪器设备的量程、精度必须满足标准要求，投入使用前要进行技术验证和检定校准。操作仪器的人员必须经过培训和授权。在作业现场，设备使用前后要核查测试环境及设备功能状态是否满足工作质量要求。为防止仪器混淆，每一台设备都应有唯一性标识和档案，其中记载了其检定校准、使用存放、维修保养等信息。当然修复后的设备只有在通过校准或测试表明能正常工作后，方能投入使用。
4.流程一致是检测工作质量保证的重点
实践证明，检测工作质量保证体现在检测过程各个环节，实验室必须实现工作程序标准化，保持步调一致。从与客户协商签署委托合同（协议）、并向检测部门下发任务传递卡开始，整个工作流程就进入了标准化管理。在检测标准未规定优先采用那种检测方法时，应用附加细则对标准加以补充，以确保测试方法的一致性。也就是说，对特定的被检设备，实验室内任何一组人员的检测方法要保持高度统一。
例如对于样品的接受、管理和处置，实验室要规定如下的工作程序：检测工作受理后，双方应做好样品、附件及技术资料的交换登记。检测部门在接到任务后，应组织或指派人员实施。检测人员准备好仪器设备，保证其处于受控状态。重要检测检验用仪器设备，都应有使用说明书。检测人员应保证环境条件符合规定要求，做好环境条件的监控和记录。做好检测前的准备工作，仪器外观检查、通电预热、必要的准备工作。检测人员将接受的样品的控制状态改为“在检”状态，严格按照检测标准或规范及作业指导书进行检测。检测过程中出现边缘数据，应重复测量三次以上确定。检测工作完成后，检测人员将样品的控制状态改为“检毕”状态，按规定存放。已检的样品应由检测人员与客户当面交谈，在清点数量、附件和技术资料后，完成交接。检验过程中填写的原始记录，经审核无误后，交于报告编制人。出具的检测报告经报告编制人、审核人、批准人签字确认后方可交付客户。
5.结果控制是检测工作质量保证的核心
检测检验结果质量控制是有计划的活动，实验室应制定出有确定的控制对象和控制方法的年度计划。监控数据的记录方式要便于发现其变化趋势，在可能的情况下应采用统计技术对结果进行审查。开展结果质量控制的方式有：使用有证标准物质进行监控；参加实验室间比对，三家以上实验室的比对结果更具有说服力，当检测检验结果离群时，启动纠正措施程序，进行纠正措施验证；使用相同的或不同的方法对同一台机电设备进行重复安全检测检验，比较检测结果，该方法适用于正在进行的检验对象，也适用于留样再测对象；对存留物品进行再检测检验，分析留样前后的结果数据；分析一个物品不同特性结果的相关性，如果一个物品不同特性检测结果的关联性表现出脱离相关理论基础，对检测结果就应怀疑。
最后，实验室将记录并计算整理的结果数据，与事前确定的质量控制界限进行比对、分析。当发现质量控制数据将要超出预先确定的判断依据时，应迅速进行分析，并防止出现报告错误的结果。
6.反馈纠正是检测工作质量保证的途径
在长期的煤矿机电设备安全性能检测检验活动中，肯定会出现这样或者那样的问题，检测工作质量就是在不断纠正错误的过程中得到提高的。研究表明，检测工作质量问题可以通过实验室内部或外部审核、管理评审、客户的反馈或员工的观察等各种活动来识别，其中客户反馈极其重要，它既能了解检测人员现场的服务态度，又能知道客户对实验室技术能力、工作效率、工作质量的总体印象。征求客户意见可以由电话咨询或者问卷调查两种方式来进行。
面对通过各种渠道收集到的检测工作质量问题，实验室首先要组织调查、研究分析不符合产生的直接原因，必要时分析诸如检测方法程序、员工技能培训、仪器校准精度等不符合产生的潜在原因。当找到出现问题最根本原因的时候，选择最佳方案完成纠正。最佳纠正措施应考虑：问题的严重程度；风险的大小；问题发生的根本原因和再次发生的可能性；实验室的技术力量和经济水平；消除不符合原因的程度。
7.记录报告是检测工作质量保证的关键
报告是21世纪经济报道与浩泽净水联合发起的“净泽计划公益项目的成果之一。研究人员历时一年，实地调研7个城市，综合调研20个重点城市，对城市饮用水水源的基本情况、水源地水质和水污染情况、保护和水污染治理情况等实施了详细调研分析。
报告选取中国20个重点城市(地区)作为考察对象，其中实地调研北京、上海、广州、西安、三江源、重庆和长沙7座城市(地区)。这些城市覆盖了中国大部分地区，人口密集、经济较为发达。调研饮用水水源的形式包括地表水、地下水等;为便于更好的比较，调研组还对水资源极度紧缺的新加坡供水系统进行了实地调研和访谈。报告以实地调研、专业人士访谈、检索的方式开展，数据来源于政府主管部门、企业公开公布的信息、专业人士提供资料及研究论文、调研组实测数据。报告将相关数据与实地检测数据结合，更好接近真实现状。
报告显示，在我国，目前水质状况有五大规律：
[关键词]果蝇S2细胞；荧光素酶；启动子；报告基因；转染
在研究基因功能的过程中，不可避免地要研究基因的调控机制，而基因的表达产物复杂且难以对其定量和定性，要在细胞生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难。但报告基因分析系统的发现给基因调控与表达的研究带来了新的希望。近年来，报告基因系统的研究取得了快速的发展。报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控，因此，对真核基因调控的了解可以不通过直接测定调控元件调节转录速率的能力，而是把顺式调控元件与报告基因的序列连接起来，在基因转录的过程中测定报告基因转录产物的表达量，从而判断相应的顺式作用元件的调控能力。作为报告基因必须具备以下特点：（1）由原核基因编码的基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；（2）细胞内其他基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高、重复性好。该技术的主要优点是灵敏度高、可信性大及检测方便且适合大规模检测，目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件[13]。荧光素酶（LUC）报告基因来源于北美萤火虫，能催化萤火虫的氧化性羧化作用，同时发射出光子，可被光度计捕获定量。LUC的分析具有快速、方便、线性较好等优点，正成为最广泛使用的报告基因。pGL3系列的质粒就是带有LUC报告基因的质粒载体，我们可以利用这一系列的工具载体研究果蝇中基因的表达调控方式，其中pGL3Control带有SV40的启动子和增强子。SV40是一种猴病毒，它的增强子/启动子区域可使其在大多数细胞株中有高度的组成性表达，因而广泛用于构建真核基因的表达载体，因此pGL3Control可作为检测体系中的阳性对照。但由于SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达，所以我们将果蝇actin5C蛋白的启动子（pac）[4]构建到质粒pGL3Basic中，得到了高表达LUC的重组载体pGL3pac。这一质粒的构建可为研究果蝇中基因的调控方式奠定基础，同时也可为研究其他报告基因在不同细胞中的表达提供借鉴作用。
1材料和方法
1.1菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α（作者所在实验室保存），质粒pGL3Basic(Promega公司)，pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen公司)，限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ及T4连接酶、DNA聚合酶(TaKaRa公司)，小量胶回收试剂盒(TaKaRa公司)，中量质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)，LUC检测试剂盒(Promega公司)，S2细胞Schneider培养基(Invitrogen公司)，胎牛血清（Gibco公司）。
12方法
1.2.1pac启动子的获得以pAc5.1/V5His/LacZ质粒为模板进行PCR扩增。上游引物5′GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3′，下游引物5′GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3′（划线部分分别为XhoⅠ和HindⅢ酶切位点）。PCR反应参数为：95℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃延伸10min。
1.2.2重组质粒的构建鉴定与中量抽提纯化PCR产物分别经XhoⅠ、HindⅢ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切片段，与同样经酶切、割胶回收的pGL3Basic质粒于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含氨苄青霉素（终质量浓度为50mg・L-1）的固体培养基上，37℃过夜培养。挑阳性克隆提取质粒，酶切和测序鉴定，鉴定正确的质粒经中量质粒抽提试剂盒提取纯化。
1.2.3S2细胞培养及瞬时转染S2细胞由本实验室冻存，使用Schneider培养基，补以10%胎牛血清。S2细胞培养在28℃无CO2培养箱中，根据其生长状态，按一定比例每3d传代1次。待细胞生长状态良好时进行瞬时转染分析。转染时在12孔板中接种1×106个细胞，加入1ml含10%胎牛血清的Schneider培养基，置28℃无CO2培养箱中培养6～16h[细胞生长至对数生长期达（2～4）×106ml-1]，在1.5mlEppendorf管中准备以下试剂：溶液A，12μl2mol・L-1CaCl2，5μg重组质粒，1μgpAcLacZ质粒，加入双蒸水至总体积为100μl，混匀待用；溶液B，100μl2×HBS。将A溶液缓慢加入B溶液中，轻轻混匀，室温放置30min，以形成Ca3PO4DNA复合物。将Ca3PO4DNA复合物逐滴加至细胞上，混匀后置28℃无CO2培养箱中继续培养，24h后用含10%胎牛血清的Schneider培养基给细胞换液。细胞转染48h后裂解细胞，先吸去培养液，用PBS洗2遍，在每个培养孔中加入200μlReporterlysisbuffer，保证充分覆盖细胞，冻融1次以确保细胞裂解，将细胞裂解液移至1.5mlEppendorf管中，振荡10～15s，离心（12000×g，2min，4℃），转移上清于新管。制备好的细胞裂解液可用于测定或贮存于-70℃备用。
1.2.4LUC和β半乳糖苷酶(βgal)活性测定取制备好的细胞裂解液进行LUC和βgal活性的测定。LUC活性测定前取20μl平衡至室温的细胞裂解液，加入80μlLUC底物，迅速混匀，置光度计中，记录读数。βgal活性测定根据分子克隆的方法，在每个用于测定转染细胞裂解物的Eppendorf管中加入100×Mg2+3μl、1×ONPG66μl、细胞裂解物30μl、0.1mol・L-1Na3PO4201μl，混匀。置37℃保温30min，以500μl1mol・L-1Na2CO3终止显色反应。置酶标仪上，在波长420nm处读光吸收值来表示βgal的活性，以共转化的βgal活性作为内源对照，以/βgal活性的值为系数，比较各组在转化效率相同时LUC活性的相互关系。以没有任何插入片段时pGL3Basic的LUC活性为1，比较加上插入片段pac启动子后的LUC活性增加的倍数，即LUC的相对活性，以反映LUC基因表达的相对水平。
2结
果
2.1重组载体的构建鉴定与纯化以pAc5.1/V5His/LacZ质粒为模板，通过上游引物和下游引物PCR扩增获得pac启动子2500bp基因片段（图1），用XhoⅠ、HindⅢ双酶切后克隆到载体pGL3Basic中（图2）。提取重组阳性质粒，XhoⅠ、HindⅢ双酶切后得到2500bp的基因片段（图1）。经测序鉴定，阅读框架不变。鉴定完成的重组质粒经过质粒中量抽提试剂盒提取纯化，得到符合转染所需的高纯度高浓度的重组质粒pGL3pac，经测定其260nm的OD值，计算得到其浓度为0.99μg・μl-1，A260nm/A280nm为1.81。
2.2S2细胞的瞬时转染分析转染结果显示，pGL3Basic和pGL3Control中LUC的相对活性无明显差异，提示SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达或低表达。而pGL3pac中插入了pac启动子，LUC的相对活性明显增高。pGL3pac在果蝇S2细胞中LUC的活性是pGL3BasicLUC活性的近2.7万倍。见表1。表1瞬时转染后各组分酶活性值
3讨
论
LUC是现在常用的一种报告基因，因其无放射性、检测快、灵敏度高、半衰期短、线性好等特点而得到广泛的应用。我们构建了pGL3pac这一重组质粒，使得在果蝇S2细胞中能够高表达LUC，为进一步的实验提供了一个好的工具。首先，它可作为基因启动子分析研究中的阳性对照，通过与该重组质粒的转染结果比较，从而判定不同顺式作用元件对转录的影响。其次，我们可以将目的基因某一区域的启动子元件插入到重组质粒pGL3pac启动子的上游或下游，通过LUC表达量改变的放大作用，进一步分析这些启动子元件的生物学作用，找到在转录过程中起到关键作用的核心启动子序列。在此基础上，我们还可以了解特定的反式作用因子对基因表达的影响。再次，还可以将目的基因自身的5′端或3′端的UTR序列插入到LUC基因的上下游，通过检测LUC的水平，为翻译水平的调控提供依据。在实验过程中，有很多方面值得我们注意。第一，在重组质粒利用中量试剂盒抽提纯化时，想得到浓度高的产物，应注意在菌液的培养量和培养时间上进行调整。因实际环境的不同，按照操作说明所示的条件往往难以得到足够的质粒量，通过增加培养的菌液量和延长培养时间可取得很好的效果。由于所得的质粒是细胞转染所需，故在抽提纯化时应特别强调无菌的原则。第二，在转染实验中，重组质粒pGL3pac必须共同转染表达另外一带有报告基因的质粒以衡量转染效率。我们选择了pAcLacZ，该质粒含lacZ基因，能够表达βgal，利用βgal水解底物ONPG的能力计算出βgal的活性，以此作为内源对照衡量不同组分的转染效率。这个质粒与目的质粒的转染比例对于结果有很大的影响。因βgal的活性在0.2～0.8之间符合线性范围，所以可根据这一要求摸索合适的转染比例，通过实验可得出两者在5∶1浓度比时较合适。另外，还可以选择带有其它报告基因的质粒载体，如phRL是一种带有海肾荧光素酶（RLUC）报告基因的质粒载体，如果选择phRL作为共转质粒则可通过在一管细胞裂解液中先后加入不同的底物，用同种仪器测定酶的活性即可，因其测定的两种酶的活性在同一数量级而且减少实验步骤，使实验数据更加可靠，实验过程更加简便[5]。第三，我们是通过瞬时转染得出结论，为排除一些因素的影响，转染实验必须重复3或4次，本实验的转染数据即是3次实验的平均值。在实验中我们选择了pac替代pGL3Control中的SV40启动子，主要是因为果蝇actin5C蛋白组在果蝇体内为组成性表达且不需诱导，因此，利用pac作为替换启动子，不仅能产生较好的效果而且可简化实验操作。这一质粒的构建不仅为我们在细胞水平利用报告基因系统研究果蝇中基因的表达调控方式提供工具载体，而且它的构建方法提示我们可通过相同的途径构建适合转染不同类型细胞的带有报告基因的质粒载体，作为相应研究的基础。
[参考文献]
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