重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是外科最为凶险的急腹症之一，起病急，发展迅速，病情危重，并发症多，病死率高。其中SAP患者80%死亡是由胰腺及胰周组织的继发感染引起，90%以上的继发感染是由肠道细菌所致，肠源性感染是导致SAP死亡的重要原因[1]。而肠道黏膜屏障功能(Intestinalbarrierfunction，IBF)受损及肠道细菌移位(Bacterialtranslocation，BT)目前被认为是最可能的病原菌来源途径[2]，预防继发感染是SAP治疗的主要目标。微生态制剂具有提高肠道内源性防御屏障，调整肠道菌群失衡，提高机体免疫力作用，因此通过合理应用微生态制剂，为防治SAP感染并发症提供了一个有效的生物途径。
一重症胰腺炎感染机制
1．SAP与肠道屏障受损的相关性
胰腺继发细菌感染有三个途径:淋巴途径、血液途径和跨黏膜途径。近期研究显示，胰腺坏死组织感染主要来源于从肠腔移位的细菌。在SAP患者中，革兰阴性杆菌是大部分胰腺及其周围组织感染的主要病原菌[2]。胰腺坏死组织感染在疾病早期迅速发生，且导致死亡率显著增加。肠源性细菌感染是影响SAP生存率的主要因素。SAP早期就可发生内毒素血症，内毒素来源于肠道细菌，对机体产生有害影响。细菌和内毒素的移位导致了胰腺感染，并且加重了胰腺炎的病情。正常情况下，胃肠道有屏障功能，防止肠腔内细菌透过肠壁进入全身脏器和组织。但在某些病理状态下肠道内细菌及其产物透过肠壁到达肠系膜淋巴结及肝、脾、肺等全身远膈脏器的过程统称为肠菌移位(bacteriumtranslocation，BT)。在动物实验中，已获得肠细菌移位的证据，并证明可由此而引起多器官功能障碍综合症(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)。在发生SAP后，肠黏膜屏障功能出现障碍，从而发生BT导致的胰腺感染。SAP起病后数小时，调节肠道动力的胃肠多肽和激素分泌紊乱，小肠动力明显下降，这些动力异常可导致细菌过度生长，并黏附于肠壁，释放大量毒素[3-5]。Cicalese等[4]通过荧光示踪剂观察急性胰腺炎动物的肠蠕动并做细菌培养，发现随着肠运动减慢，肠内细菌增多，邻近的肠系膜淋巴结内的细菌也增多。SAP发生后细胞免疫和全身吞噬功能均有所下降，导致全身和局部清除细菌的能力下降，坏死胰腺组织易被肠道细菌感染。
2．SAP与免疫屏障损伤的相关性
肠黏膜免疫屏障由肠相关淋巴组织和弥散免疫细胞组成，其中起核心作用的是分泌型IgA(SIgA)。SIgA是肠道分泌物中含量最丰富的免疫球蛋白，能与细菌结合形成抗原抗体复合物，使细菌不能从肠腔进入肠壁。SIgA还具有能抑制肠道内的细菌黏附肠道黏膜表面，中和肠道内的毒素、酶和病毒，对肠道菌群中的G-杆菌具有特殊的亲和力，对一些抗原物质具有封闭作用，同时具有对嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒作用和ADCC作用。王兴鹏等[6]观察急性坏死型胰腺炎（acutenecrotizingpancreatitis，ANP）大鼠早期肠黏膜上皮细胞凋亡的发生及其演变规律，研究发现ANP大鼠回肠Peyer集合淋巴结中出现大量凋亡淋巴细胞。作为肠道免疫屏障的一部分，淋巴细胞大量凋亡可能引起肠道免疫防御功能下降，促进了肠道细菌和毒素的移居。akeyama等[7]提出SAP时肠道相关淋巴组织的特异性与非特异性免疫功能受损，周围循环淋巴细胞凋亡增加，肠道局部及全身的免疫力下降，容易导致BT。
3．SAP与生物屏障损伤的相关性
正常肠道内细菌相互依赖、相互制约构成肠道微生态系统。SAP时小肠、结肠致病菌大量繁殖，导致肠道生物屏障破坏。Van等[8]报道，SAP大鼠十二指肠革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌、厌氧菌均过度生长。SAP时肠屏障功能障碍（intestinebarrierfunctionaldisturbalice，IBFD）的直接后果是肠道BT导致胰腺坏死组织及其他远隔脏器感染，而间接作用是肠道细菌、内毒素进入体循环导致肠源性内毒素血症，刺激已经活化的单核和巨噬细胞释放过量的细胞因子和炎性介质，促使全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)的发生，对胰腺等脏器构成严重的“第二次打击”，甚至诱发和加重MODS。
二微生态制剂的作用机制
微生态制剂又称微生态调节剂，是根据微生态原理，调整微生态失调，保持微生态平衡，利用对宿主有益无害的正常菌群或其促进物质制成的制剂是用来纠正微生态失衡，保持微生态平衡，提高宿主健康状态的益生菌，或其代谢产物和生长促进物质的制品。其中包括益生菌(probiotics)、益生元(prebiotics)、合生元(synbiotics)3类，其中益生菌的应用最为广泛[9]。
益生菌的定义为:含活菌和(或)菌体组分及代谢产物的死菌的生物制品，经口或其它黏膜投入，旨在黏膜表面处改善微生物与酶的平衡或刺激特异性与非特异性免疫。作为益生菌必须具备的要素包括:(1)能与人体细胞黏附;(2)在胃酸和胆汁中有较好的稳定性;(3)能产生抗微生物物质或有抗菌活性[10]。最常用的益生菌是乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)，包括乳杆菌、肠球菌和双歧杆菌。Doron等[11]研究证明提供肠道益生菌双歧杆菌、乳酸杆菌，补充肠道正常菌群，抑制致病菌生长，刺激机体免疫反应，可产生一系列化学诱导剂，调节细胞因子或细胞因子样分子如细菌素产生，促进产生SIgA，增强体液免疫，阻止菌群移位，减少内毒素产生，从而减轻对多脏器损伤。
三微生态制剂在ASP中应用状况
1．动物实验研究
Raffaele等[12]对经益生菌治疗SAP大鼠的胰腺以及肠系膜淋巴结进行病理检查，结果显示益生菌组中胰腺纤维化程度，胰腺组织水肿坏死程度，浸润组织的单核细胞及多核细胞数量均比对照组显著低。实验证明肠内营养添加益生菌治疗ASP能显著的降低其严重程度。国内杨建军等[13]对SAP大鼠实施益生菌及肠外、肠内营养，观察他们对肠道黏膜地址素细胞黏附分子-1（MAdCAM-1）表达及免疫屏障的影响，研究发现SAP大鼠肠外营养一周后，出现Peyer结、肠黏膜MAdCAM-1表达下降，并伴有GALT萎缩，CD4、CD8T细胞数量减少，IgA分泌降低。而添加益生菌治疗后dCAM-1表达明显优于肠外营养组，CD4，CD8T细胞数量及IgA表达亦高于肠外营养组。益生菌组总体水平高于肠外营养联合肠内营养组，尤其是Peyer结MAdCAM-1、CD8表达高于肠外营养联合肠内营养组。提示益生菌治疗SAP大鼠能够改善地址素MAdCAM-1表达，促进肠道淋巴细胞归巢及淋巴组织的增生，从而对肠免疫屏障具有维护作用。
2．临床实验研究
Kecsks等[14]以益生菌制剂治疗急性胰腺炎患者，探讨益生菌在治疗急性胰腺炎中的作用，研究临床疗效结果显示，益生菌治疗组的住院时间、SIRS发生率明显低于对照组，同时益生菌治疗组的症状和体征缓解时间、血淀粉酶恢复时间、住院时间均明显低于对照组，差异有统计学意义，而SIRS、霉菌感染及MODS的发生率也明显低于对照组。研究结论表明益生菌制剂治疗急性胰腺炎，能有效缓解急性胰腺炎病情，降低并发症的发生率，缩短住院时间。国内陈智等[15]观察双歧杆菌制剂对急性重症胰腺炎感染的治疗作用。他们对收治9例急性重症胰腺炎患者投以双歧杆菌制剂，经临床观察及大便细菌培养。研究结果发现双歧杆菌制剂可改善临床症状，细菌培养显示患者肠道双歧杆菌、乳酸杆菌总数明显增加，肠道菌群接近正常比例。双歧杆菌制剂对急性重症胰腺炎合并感染有辅助治疗作用。国内李咏梅[16]观察益生菌对SAP的辅助治疗效果:发现在传统治疗基础上，口服益生菌制剂金双歧，患者腹痛缓解时间，血淀粉酶恢复时间比对照组显著降低，平均住院时间明显缩短，早期应用益生菌，可改善预后。
四进展
Bengmark[17-18]于1998年提出“生态免疫营养”的概念，即在免疫营养支持治疗的基础上，增加以益生菌为主的生态制剂来增强营养支持的效果，利用肠道内有益菌群的生物拮抗作用，减少致病菌的过度生长，同时提高肠道细菌的酵解能力，以改善肠道内环境，最终达到维护肠道微生态及肠道屏障功能的目的。但肠内营养与微生态制剂的联合应用，2002年才见文献报道，Rayes等[19]给予肝移植病人早期使用含乳酸杆菌和膳食纤维的肠内营养，与常规肠内营养和选择肠道去污疗法比较，结果显示生态免疫营养可明显地降低肝移植术后的感染率。应用微生态制剂进行ASP早期肠内生态营养治疗的研究正在起步中，目前以动物实验研究结果为主，较大规模的临床报道较少。微生态制剂防治ASP继发感染具有广阔的应用前景，但还有众多亟待解决的问题。随着人们对ASP继发感染发生机制的不断深入研究和早期肠内营养的推广应用，微生态制剂有望成为人们战胜疾病的另一个行之有效的治疗方法。
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肠道微生物也有“肥胖时的记忆”？
记得自己的肥胖史的，不仅有大脑，还有肠道中的小小微生物。像《自然》杂志中报告的那样，魏茨曼科学研究所的研究人员在小鼠模型中发现，肠道微生物可能对节食后的体重反弹起着至关重要的作用。在经历了“节食-减肥成功-体重反弹”这一过程之后，所有小鼠的身体系统都已经恢复到了正常状态，除了肠道微生物。成功减肥6个月后，以往肥胖的小鼠的胃肠道内又重新出现了异常的“肥胖”微生物。
研究人员表示，胃肠道中的“肥胖微生物”是加速节食后体重增加的主要原因。肥胖的小鼠在节食并成功减肥后，其肠道内的微生物会保留着以前肥胖时的“回忆”。当小鼠重新开始食用高热量食物，或者是过量饮食的时候，这种保持着肥胖回忆的固执的微生物就加速了体重的增加。科学家们发现，当研究人员通过给小鼠服用广谱抗生素来消除胃肠道内的微生物时，这种加速效应就消失了。在另一项实验中，研究人员将从无肥胖史小鼠的胃肠道中提取的微生物植入到一组无菌小鼠中，将从肥胖小鼠胃肠道中提取的微生物植入到另一组无菌小鼠中，并给两组小鼠饲喂同样的高热量食物。结果发现，被植入了肥胖小鼠微生物的一组无菌小鼠的体重增速明显大于另一组无菌小鼠。这也都说明了，保留有肥胖记忆的微生物对体重循环有着重要影响。
“肥胖微生物”究竟怎样加速体重反弹？
通过将遗传和新陈代谢的方法相结合，研究人员又识别出了两种会影响微生物对体重反弹影响的分子。这两种分子均隶属于一种被称之为“黄酮类”的有机化学物质，这类化学物质是通过食用某些蔬菜而摄取的。但是当成功节食后的小鼠摄入这两种物质后，体内的“肥胖微生物”就将这两种物质降解掉了，这样，这两种分子在成功节食的小鼠体内的水平，要显著低于无肥胖史的小鼠。研究人员发现，在正常情况下，这两种黄酮类物质是能够在脂肪新陈代谢的过程中，促进能量消耗的。如果这两种黄酮类物质的水平较低，那么通过脂肪来释放能量的过程就会受到抑制，导致那些曾经通过节食成功减肥的小鼠，在恢复高热量饮食的时候会积累更多的脂肪。
体重循环会威胁健康吗？
关于体重循环是否会对身体产生不良影响，一直都存在不小的争论。曾有研究发现，体重循环与心脏病、糖尿病等疾病的患病风险增加之间均存在相关：
1.体重循环会降低胰岛素的敏感性，增强胰岛素抗性。
2.体重循环会降低体内的“好胆固醇”――高密度脂蛋白胆固醇的水平，并增加低密度脂蛋白胆固醇的水平。
3.体重循环会导致血压水平上升。
4.体重循环还与体内炎症水平高之间存在相关。
5.还有研究发现，相比于一直保持肥胖，体重循环还有可能会增加整体的死亡风险。
但是俄亥俄大学也曾在小鼠模型中发现：处于体重循环的小鼠的平均寿命（2.04岁）与正常小鼠的平均寿命（2.09岁）之间并不存在显著差异。但是，一直保持肥胖状态的小鼠的平均寿命则相对较短（1.5岁）。这也表明，体重循环对身体健康可能并不存在显著的负面影响。不过总的来说，大多数人，当然还是希望自己能够一直保持苗条吧！
关键词：微生态制剂；溃疡性结肠炎；效果
在临床疾病中，溃疡性结肠炎是非特异性肠道炎症，病因未完全明确，多数学者观点是发病的相关因素包括机体免疫以及遗传等，免疫调节出现异常是主要的原因[1]。传统治疗方法是糖皮质激素等，但是容易出现复发。近几年来，在防止溃疡性结肠炎方面，微生态制剂得到一定的应用。
1资料与方法
1.1一般资料选择2011年10月~2013年10月在我院接受治疗的溃疡性结肠炎患者80例，男为48例，女为32例，平均年龄是（38.5±9.0）岁，病程是0.6~7.5年，平均为（4.5±0.4）年。将患者随机分组，分为观察组和对照组，每组40例。
1.2方法两组患者应用常规内科治疗的方法，服用水杨酸制剂，进行灌肠，应用糖皮质激素，强化营养支持。观察组患者在此基础上，应用微生态制剂双歧三联活菌，2粒/次，3次/d。对照组进行常规治疗。进行6个月治疗，进行观察，观察项目包括：①临床症状，②大便的性状以及次数，③腹痛和腹胀的情况。进行常规检查，并对不良反应进行观察。
1.3疗效标准治愈：临床的症状消失，肠镜检查，显示为基本正常；有效：临床的症状有所改善，肠镜检查糜烂等症状有所好转；无效：临床症状没有改善或者是恶化，和治疗前相比，肠镜检查没有改善[2]。总有效率为治愈率和有效率。
1.4统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计分析，P
2结果
2.1两组的临床症状对比两组患者在临床症状方面，和治疗前进行对比，改善明显。在血便情况改善方面，观察组明显大于对照组，P
2.2治疗总有效率对比观察组治愈率为40.0%，有效率为55.0%，无效率为5.0%，总有效率为95.0%；对照组治愈率为5.0%，有效率为70.0%，无效率为25.0%，总有效率为75.0%，在总有效率方面，观察组明显的大于对照组，P
2.3活动指数对比在治疗前，观察组和对照组活动指数分别为（8.8±2.7）、（9.3±2.6），治疗后分别为（2.4±1.6）、（3.8±1.7），经过治疗，两组的活动指数明显的下降，观察组降低的幅度明显的优于对照组，P
2.4不良反应在治疗前后，两组患者进行肝肾功能检查，均是正常的范围内。观察组2例患者存在消化道反应，对照组3例患者存在消化道反应，经过对症治疗，明显好转。
3讨论
溃疡性结肠炎是难治性疾病，病因较多，影响因素复杂，发病的年龄通常是20~50岁。在临床上，主要表现为：①腹痛，②腹泻，③黏液脓血便，病程出现迁延，并且多会反复发作。
近几年来，相关的研究显示，在溃疡性结肠炎发病过程中，肠道细菌能够发挥重要的作用。肠道的菌群出现失调，肠道菌群紊乱，导致肠内的食物残渣出现不正常发酵，出现腹胀等症状。上述的研究使得在溃疡性结肠炎治疗中，微生态制剂得到广泛的应用，微生物制剂作用的机制可能是：①受体竞争，于肠黏膜表面，肠腔内的微生物病原体和微生态制剂对有限受体进行竞争，限制病原体作用；②微生态制剂会释放出化学物质，如抑酸、过氧化氢等，抑制肠腔病原体生长；③刺激肠黏膜相关的淋巴组织，调节肠黏膜上皮细胞；④强化黏膜的屏障功能；⑤在肠固有膜内，T淋巴细胞会出现凋亡[3]。
在本次研究中，观察组治疗总有效率为95.0%；对照组为75.0%，观察组明显的大于对照组，观察组的临床症状改善优于对照组，活动指数降低的幅度大于对照组，显示对于溃疡性结肠炎的治疗，微生态制剂的治疗效果较好，在临床上能够广泛应用。微生态制剂是安全药物，但是，可能会发生不良反应，如菌血症等，微生态制剂多是蛋白或者是细菌，可能会导致过敏反应，在本次研究中，未出现明显的不良反应，但是，对于免疫能力较低患者，是否会出现不良反应，值得深入研究[4]。
参考文献：
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9月-2016年9月收治的116例UC患者，随机分为两组，各58例。对照组予SASP治疗，观察组在此基础上联用微生态制剂，比较两组治疗效果及安全性。结果：与对照组的79.31%相比，观察组总有效率为93.10%，明显提高，差异有统计学意义（P
【关键词】柳氮磺胺吡啶；微生态制剂；溃疡性结肠炎；疗效；安全性
doi：10.14033/ki.cfmr.2017.7.015文献标识码B文章编号1674-6805（2017）07-0030-02
溃疡性结肠炎（UC）为消化内科常见病，是一种多病因引发的、异常免疫介导的肠道慢性及复发性炎症，病变主要限于大肠黏膜及其下层，呈弥漫性连续性分布，临床表现主要为反复发作的腹泻、黏液脓血便、腹痛等，病程长，易复发，严重影响患者生活质量。临床中以内科治疗为主，柳氮磺胺吡啶（SASP）因疗效确切、价格低，仍是轻、中度UC患者的首选药物。近年来，肠道微环境在UC发病机制中的作用逐渐受到重视，微生态制剂治疗UC也成为关注热点[1]。本研究对笔者所在医院2014年9月-2016年9月收治的116例UC患者分别采取SASP与微生态制剂联合及单纯SASP治疗，以探讨联合用药的疗效及安全性，现作以下分析。
1资料与方法
1.1一般资料
选取笔者所在医院2014年9月-2016年9月收治的116例UC患者，随机将其分为两组，各58例。观察组男32例，女26例，年龄20～69岁，平均（39.12±6.25）岁，病程0.51～9.45年，平均（4.73±0.95）年；对照组男31例，女27例，年龄22～68岁，平均（39.10±6.24）岁，病程0.47～9.49年，平均（4.75±0.96）年。纳入标准：（1）符合《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》中诊断标准[2]；（2）为轻、中度活动期UC患者；（3）停用其他治疗药物至少1周；（4）自愿参与研究，签订同意书。排除标准：（1）严重心肝肾等重要脏器及内分泌、血液系统疾病者；（2）活动性胃和十二指肠溃疡及消化道肿瘤者；（3）妊娠、哺乳期妇女及精神疾病者；（4）对水杨酸制剂过敏者。两组患者基础资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2方法
所有患者均补充蛋白质，改善全身营养状态，并予卧床休息和全身支持治疗。对照组口服柳氮磺胺吡啶肠溶片（山西同达药业有限公司，国药准字H14022874），1g/次，4次/d，进餐时服用为佳；观察组在此基础上联用微生态制剂，口服双歧杆菌三联活菌胶囊（上海信谊药厂有限公司，国药准字S10950032），420mg/次，3次/d，饭后0.5h温水服用。4周为1个疗程，2个疗程间间隔1周，共治疗3个疗程。
1.3观察指标
（1）比较两组治疗前后主要症状变化情况，症状评分为腹泻、腹痛采用3分制，黏液血便、里急后重6分制，0分为无明显表现，3分或6分为持续不耐受表现，分数越高，症状越严重；（2）于治疗前后采用免疫组化法对患者肠黏膜局部白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、白介素-18（IL-18）细胞因子水平进行检测，记录数值变化；（3）进行肝肾功能、血尿常规及大便常规检查，观察药物不良反应。
1.4疗效判定标准
显效：临床症状消失，结肠镜检查溃疡愈合，黏膜大致正常；有效：临床症状基本控制，大便常规检查未见脓血，无明显腹泻、腹痛，结肠镜检查黏膜炎症、溃疡明显好转；无效：以上各指标均无改善或加重。总有效率=（显效例数+有效例数）/总例数×100%。
1.5统计学处理
采用SPSS19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P
2结果
2.1两组患者临床疗效比较
与对照组的79.31%相比，观察组总有效率为93.10%，明显提高，差异有统计学意义（P
2.2两组患者临床症状改善情况比较
治疗后两组患者腹泻、腹痛、黏液血便及里急后重主要症状均明显改善，差异有统计学意义（P
2.3两组患者细胞因子水平变化比较
治疗后两组IL-6、IL-18水平明显降低，IL-10水平升高，观察组改善幅度均优于对照组，差异有统计学意义（P
2.4两组患者不良反应发生率比较
对照组出现恶心、厌食各2例，头痛1例，不良反应发生率为8.62%（5/58）；观察组恶心2例，头痛、搔痒各1例，不良反应发生率为6.90%（4/58）。两组均无严重不良反应，比较差异无统计学意义（字2=0.12，P>0.05）。
3讨论
UC在我国的发生率呈逐渐上升趋势，其病因仍未完全明确，以往研究认为其发病机制主要为：黏膜屏障自身缺陷导致部分因子较易穿过肠黏膜，引起组织损伤；巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞于最初损害部分聚集，随着一系列炎症递质的产生，炎症被逐级放大，最终诱发UC，其是遗传、环境、免疫因素等多因素相互作用所致[3]。
目前临床对于轻、中度UC患者以药物治疗为主，主要包括氨基水杨酸制剂、皮质类固醇、免疫抑制剂等，其中SASP为本病的经典、常用药物，该药经口服后在肠道内分解成5-氨基水杨酸（5-ASA）和磺胺吡啶，其药理作用的发挥主要通过5-ASA抑制前列腺素合成、清除氧自由基及诱导淋巴细胞凋亡等，从而起到抗炎效果[4]。但同时由于SASP具有抗菌作用，加之UC患者对抗生素的大量使用，使细菌对SASP的分解受到抑制，5-ASA在肠内浓度不高，一定程度上限制疗效。
近年来研究发现，肠道内菌群失调在UC的发病过程中起着重要作用。刘志威等[5]研究显示，UC组患者大肠杆菌数量明显高于健康对照组，且活动期高于缓解期，双歧杆菌、乳酸杆菌数量则明显减少，活动期少于缓解期，说明肠道正常菌群对黏膜免疫系统发育和功能具有重要影响。微生物制剂对肠道黏膜屏障的作用机制主要体现在：（1）改变肠道菌群组成，与微生物病原体进行受体竞争，减少致病菌及其所致炎症，改善肠功能；（2）参与肠道局部细胞和体液免疫，诱导淋巴细胞凋亡等；（3）抗菌、抗病毒作用可与黏膜上皮细胞结合，提高屏障防御功能；（4）通过释放细菌素、乙酸等，抑制病原体生长[6-7]。本研究中采用的双歧杆菌三联活菌胶囊由双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及粪肠球菌组成，可直接补充活性益生菌，抑制肠道中致病菌，减少肠源性毒素，减少炎症刺激，还能合成机体所需维生素及促进营养物质吸收，提高免疫力。本研究结果显示，与对照组的79.31%相比，观察组总有效率为93.10%，明显提高（P
综上所述，SASP与微生态制剂联用治疗UC能显著提高疗效，安全性高，值得推广应用。
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关键词：血液恶性肿瘤；肠道菌群；变性梯度凝胶电泳；多样性
近年来肠道微生态的研究越来越热门，我们已经发现人体肠道微生态平衡与人体健康密切相关［1－2］。人体的很多疾病的发生与肠道微生态失衡密切相关［3－5］，其中人体癌症的发生与肠道微生态的失衡的联系备受关注，现在已经发现肠道微生态失衡会导致人体大肠癌、乳腺癌的发生发展［6－7］。关于血液恶性肿瘤与肠道微生态的关系，研究的并不是很多。血液恶性肿瘤患者的免疫力通常低下，而肠道菌群在促进人体免疫功能方面具有重要作用［8］，血液恶性肿瘤患者最常见的死因是感染，有数据表明60％～70％的白血病和淋巴瘤患者死于感染［9］，免疫力低下也是易发生感染的原因［10］，因此关于血液恶性肿瘤与肠道微生态关系的研究显得尤为重要。本实验主要通过DGGE技术在分子水平上对血液恶性肿瘤患者肠道菌群结构特征进行研究，以期为血液恶性肿瘤的预防与抗感染治疗以及引入肠道菌群这一新的治疗靶点提供依据。
1材料与方法
1．1样本收集
血液恶性肿瘤患者粪便样品由内蒙古自治区人民医院提供（表1），健康对照组来源于大连医科大学学生自愿者。在取样的4周内，受试者无胃肠疾病发生、同时未接受抗生素治疗以及未服用益生菌和益生元等微生态制剂。样品的采集得到当地伦理委员会和本人的知情。样本收集后立即冻存于－80℃备用。
1．2粪便细菌总
DNA提取将粪便样品放在冰上解冻，使用FOREGENE粪便DNA提取试剂盒（成都福际）。操作步骤按试剂盒说明书进行。
1．3PCR扩增利用整理引物对所有细菌
16SrRNA基因的V3可变区进行扩增。整理引物序列如下：上游引物341F：5′－GC夹－CCTACGGGAG－GCAGCAG－3′，下游引物518R：5′－ATTACCGCG－GCTGCTGG－3′，其中上游引物含有GC夹序列：CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGGGGCGGG－GGCACGGGGGG。PCR反应体系（50μL）：ddH2O27．5μL，10×ExPCRBuffer（Mg2＋）5μL，1％BSA5μL，dNTPs（2．5mM）8μL，上游引物F（20pmol／μL）1μL，下游引物R（20pmol／μL）1μL，DNA模板2μL，ExTaqDNA聚合酶（5U／μL）0．5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃充分延伸7min，4℃保存。2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1．4DGGE电泳
经预实验确定本实验凝胶的变性范围为30％～50％，胶板大小为14cm×12cm×1mm。在电泳槽中加入60℃预热好的TAE缓冲液，用微量进样器在加样孔中加入24μL样品（20μLPCR产物与4μL6×上样缓冲液），将电泳槽放入电泳系统中，打开电源开关，先用高压190V电泳10min，后用低压70V电泳7h，整个过程在60℃的水浴锅中进行。电泳完毕后，将胶块小心放入EB溶液中染色1h，再将胶块放入凝胶成像系统中，获得凝胶条带图像，拍照保存并对差异性条带切割回收。
1．5对差异性条带进行切胶回收并测序切割
DGGE图谱上差异性条带，用去离子水清洗3遍，然后加入40μL去离子水，将EP管放入90℃水浴10min，10000×g离心5min（TECHCOMPCT14RD）。以上述溶液为模板，利用无GC夹引物进行PCR，反应条件同上。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收里面的DNA，使用E．Z．N．A．?GelExtractionKit（OMEGAUSA）试剂盒回收DNA，操作按说明书进行。最后将回收的DNA送到大连赛拓测序公司进行测序，测序结果在NCBI数据库上经BLAST找到对应的细菌种属。1．6DGGE图谱分析利用QuantityOne软件（Bio－Rad，USA）分析PCR－DGGE胶图谱，分析内容包括凝胶中条带数目、灰度值和聚类分析，聚类分析体现相似性，用UPGMA方法计算。
2结果
2．1PCR对16SrRNA基因V3区的扩增
利用整理引物扩增血液恶性肿瘤患者和健康对照组人员肠道细菌16SrRNA基因V3可变区，结果显示扩增的特异性条带长度均在200bp左右，且无非特异性扩增片段。PCR扩增结果见图1.
2．2血液恶性肿瘤患者肠道菌群分析
血液恶性肿瘤患者组和健康对照组人员肠道菌群的分布如图2所示。从图中可以明显看出患者组与健康对照组条带有差异，患者组灰度较强的条带数目大体上比健康对照组多。虽然患者组和健康对照组自身也存在特异性，但是从图中可以明显看到在患者组有一排条带灰度特别强（图中箭头①标识），而且也显示很高的相似性，另外在健康对照组有一排条带（图中箭头②标识），健康对照组都存在，且灰度比较强，但部分患者组其条带灰度偏暗。进一步分析这种差异，利用QuantityOne软件聚类分析DGGE图谱，如图3所示，主要分为两大簇，一簇为9～11泳道，对应健康对照组，一簇为1～8泳道，对应患者组，结果显示血液恶性肿瘤组与健康对照组肠道菌群结构存在差异，且组间差异较大。
2．3DGGE图谱优势条带测序分析
在对DGGE指纹图谱进行对比分析之后，我们选择了7条主要的差异条带，进行切胶、回收、测序，然后在NC－BI数据库中进行BLAST比对，结果见表2。为确保本实验DGGE结果的准确性，我们将相同位置却处于不同泳道的几条条带分别切胶测序比对，结果显示均为同一种属。血液恶性肿瘤组与健康对照组相比，非常明显的差异条带为图2中箭头①和②所标识的，其中箭头①中G条带为Faecalibacteriumprausnitzii，相似度为100％，它属于柔嫩梭菌属，是人体肠道的常驻有益菌，箭头②中A条带和F条带都为Escherichiacoli，相似度分别为99％和100％，它属于大肠埃希菌属，在图2中我们着重列举了各组中大肠埃希菌和柔嫩梭菌在DGGE指纹图谱中的分布强度，可以明显看出在血液恶性肿瘤组中大肠埃希菌分布丰度高，柔嫩梭菌在一些患者中分布丰度比较低，所以与正常组相比，血液恶性肿瘤患者肠道大肠埃希菌呈现过度增长趋势，而有益菌柔嫩梭菌相对减少或缺失。另外某些细菌在患者肠道内呈现特异性增长，它们的鉴定结果：B为Eubacteriumrectale，C为Enterococcusfaecalis，D为Acinetobacterjohnsonii，E为Enterococcussulfureus，它们的相似度分别为100％、99％、99％、99％和99％，其中Enterococcusfaecalis为粪肠球菌，Acinetobacterjohnsonii为约氏不动杆菌，Enterococcussulfureus为硫磺肠球菌，它们都被认为是一种条件致病菌。
3讨论
3．1实验结果分析
本研究显示血液恶性肿瘤患者肠道菌群结构与健康对照组相比差异有统计学意义，具体表现为大肠埃希菌在血液恶性肿瘤患者肠道存在过度生长的趋势，有益菌柔嫩梭菌减少或缺失，另外条件致病菌粪肠球菌、约氏不动杆菌、硫磺肠球菌在个别患者肠道内数量增加。大肠埃希菌是人体的条件致病菌，为兼性厌氧菌，一方面它作为人体的生理共生菌，参与构成人体的生物屏障和免疫屏障［11］，另一方面当人体肠道菌群失调时，大肠埃希菌过度繁殖，造成菌群结构异常，甚至大肠埃希菌易位，引起二重感染及败血症等［12］。有害大肠埃希菌引起的感染也备受关注，比如由大肠埃希菌O157∶H7引起的爆发性感染［13］；刘建君［14］关于急性胆囊炎与肠道菌群关系的研究中，在急性胆囊炎患者胆汁中分离到的细菌属于大肠埃希菌属。柔嫩梭菌是肠道共生菌硬壁菌门的主要成员，是人体的益生菌，它通过降解膳食纤维产生丁酸盐而供人体利用［15］。而丁酸盐对于宿主肠道的能量供应及肠上皮细胞的发育具有重要意义，研究表明丁酸盐可促进肠系膜修复，并帮助其功能恢复，而且丁酸盐有抑制炎症细胞因子形成的作用，从而起到抗炎作用［16］。另外丁酸盐还具有抗肿瘤作用，它能够通过抑制肠上皮细胞肿瘤坏死因子的分泌，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，从而抑制结肠癌的发生［17］。柔嫩梭菌可通过其产物调节免疫反应，抑制Th17细胞的活化和促进Treg细胞的产生［18］。所以从某种程度上说，血液恶性肿瘤患者肠道内柔嫩梭菌减少，其抗炎抗感染能力也会随之下降。因此，本研究表明血液恶性肿瘤患者肠道菌群失调，条件致病菌种类和数量增加，益生菌数量和种类降低，显示肠道菌群失调可能是血液恶性肿瘤患者易感染的原因之一。
3．2研究意义
肠道菌群的稳定与人体的健康密切相关，并且肠道菌群还具有一定的抗肿瘤功能［3，19］。肠道菌群失调现已被认为是影响多种疾病发生发展的重要因素，因此我们可以通过调节肠道菌群来预防疾病的发生和改善疾病的状况。本研究通过对比血液恶性肿瘤患者与健康对照组肠道菌群结构，证实了血液恶性肿瘤患者肠道菌群结构发生改变，这将有助于血液恶性肿瘤的预防和早期诊断，同时对于血液恶性肿瘤的抗感染治疗引入肠道菌群这一新的治疗靶点提供试验依据。
3．3实验的创新性与先进性
各类白血病、恶性淋巴瘤和多发性骨髓瘤并称为血液系统三大高发肿瘤，影响这些恶性肿瘤发生的因素很多，国内外大量的研究关注点主要集中在有毒化学品甲醛等影响上［20］，但对于肠道菌群与血液恶性肿瘤的关系研究却很少，同时研究表明感染是血液恶性肿瘤患者死亡的重要原因［9］，而大部分感染是由细菌引起的，肠道菌群失调与细菌感染也是密切相关的［21］。所以本研究通过对照分析血液恶性肿瘤患者与健康对照组的肠道菌群结构，探讨肠道菌群与血液恶性肿瘤的关系，为今后临床上使用微生态制剂调节肠道菌群，从而实现血液恶性肿瘤患者的抗感染治疗提供理论依据。
3．4不足与后续设想