【摘要】目的通过HPLC法测定不同地区人工栽培金银花中绿原酸和木犀草苷的含量，考察甘肃金银花质量状况。方法绿原酸色谱柱：C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸（13∶87），流速为1.0mL/min，检测波长为327nm。木犀草苷色谱柱：苯基色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-0.5%冰醋酸（二元梯度洗脱），流速为1.0mL/min，检测波长为350nm。结果甘肃不同地方栽培的金银花中，绿原酸、木犀草苷含量分别占2.16％～3.63%、0.0532%～0.1407%，均符合中国药典以及补充检验方法的规定。结论甘肃栽培品金银花的质量与山东、河南道地产区相当。
【关键词】金银花；绿原酸；木犀草苷；HPLC
金银花为常用中药材，具有清热解毒、凉散风寒的功效，《中国药典》收载为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb的干燥花蕾或带初开的花[1]。金银花具有广泛的生态适应性，全国除西藏、青海、新疆、宁夏、内蒙古和海南以外，其他省（市、区）均有分布，野生资源比较丰富[2]。我国人工栽培金银花已有270多年的历史，近年来种植发展迅猛，山东、河南、湖南、河北、山西、甘肃、四川、贵州、新疆等地都有栽培，以山东、河南为主产区，习惯认为山东产量大，而河南品质佳[2]。金银花除在药品、保健、轻工业等领域广泛应用外，同时也是一种生态环保型的经济林木，根系发达，具有蓄水保土和防风固沙的作用，茎叶还可以做牛羊饲料，还是美化环境的花卉，人工栽培金银花其社会经济效益十分显著。
甘肃野生金银花分布于天水、陇南地区，仅有资源而无商品，2001年以来，金昌、白银、兰州和陇南等地人工栽培成功，其中金昌、陇南已经建立商品基地。目前，国内关于金银花的质量主要以绿原酸、异绿原酸、咖啡酸和挥发油等指标成分进行评价[3-5]，甘肃人工栽培的金银花质量评价未见报道，本文采用HPLC法测定甘肃栽培金银花中绿原酸和木犀草苷含量，并与国内其他产区比较，为今后甘肃发展人工资源和选择GAP适宜的基地提供依据。
1仪器、试药与样品
1.1仪器
美国Waters515型泵、Waters717自动进样器、Waters2487型紫外检测器、超声波清洗器KQ2500（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2试药
绿原酸（110753-200413）、木犀草苷（11720-200603），供含量测定，由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。
1.3样品
金银花样品分别购于金昌（金川宁远堡镇）、白银（靖远）、兰州（皋兰、兰州市城关区）和陇南（徽县）等地；山东、河南、四川为市售商品。以上均经作者严格鉴定。
2方法与结果
2.1绿原酸含量测定[1]
2.1.1色谱条件
大连伊利特C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸（13∶87）；流速1.0mL/min；检测波长327nm；柱温为室温。理论塔板数按绿原酸计算应不低于1000。
2.1.2对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品10.2mg，置50mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀释制成每毫升含45μg的溶液。
2.1.3供试品溶液的制备
取样品（过3号筛）0.5g，精密称定，置50mL容量瓶中，加50%甲醇50mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液5mL，置25mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容至刻度即得。
按以上色谱条件得到对照品、金银花色谱图。见图1、图2。
图1对照品HPLC图
图2样品HPLC图
2.1.4样品的测定
14批金银花样品按“供试品溶液制备”方法制备样品，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以干燥品计算含量，结果见表1。
2.2木犀草苷含量测定及补充检验方法[1]
2.2.1色谱条件
苯基色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈-0.5%冰醋酸，二元梯度洗脱，0～15min，乙腈10％～20%，15～30min，乙腈20%，30～40min，乙腈20％～30%；流速1.0mL/min；检测波长350nm；柱温为室温。理论塔板数按木犀草苷计算应不低于20000。
2.2.2对照品溶液的制备
精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12h的木犀草苷对照品9.40mg，置50mL量瓶中，用70%乙醇定容即得对照品储备溶液。
2.2.3供试品溶液的制备
取样品（过3号筛）2g，精密称定，置50mL容量瓶中，精密加70%乙醇50mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）60min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10mL，回收溶剂，残渣用70%乙醇溶解，转移至5mL容量瓶，并定容即得。
按以上色谱条件得到对照品、金银花色谱图。见图3、图4。
图3对照品HPLC图
图4样品HPLC图
2.2.4线性关系考察
分别精密称取2mL木犀草苷对照品储备溶液，置于10mL量瓶中，加70%乙醇稀释定容至刻度，摇匀。分别取5，10，15，20，25，30和40μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以进样量（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为：
X=0.003Y+1.5570，r=0.9999。结果表明，在0.188～1.504μg范围内线性关系良好。
2.2.5精密度试验
对同一批金银花样品（徽县）按“供试品溶液制备”方法制备，精密吸取1μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，重复进样5次，计算出峰面积RSD为1.58%。
2.2.6稳定性试验
对同一批金银花样品（徽县）按“供试品溶液制备”方法制备，分别于配后0，2，4，6，8h，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，RSD为2.43%。结果表明，木犀草苷在8h内基本稳定。
2.2.7重现性试验
对同一批金银花样品（徽县）按“供试品溶液制备”方法，取5份制备，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定木犀草苷的含量为0.0532%，RSD为1.58%。
2.2.8回收率试验
取6份已知含量的同批样品1.0g（产徽县，木犀草苷含量为0.0532%），精密称量，分别加入对照品储备溶液3mL，按供试品溶液的制备方法制备，进行测定，计算平均回收率为98.56%，RSD为2.68%。
2.2.9样品的测定
14批金银花样品按“供试品溶液制备”方法制备样品，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以干燥品计算含量，结果见表1。表114批金银花样品含量测定
3讨论
甘肃省6个不同地方栽培的金银花中，绿原酸、木犀草苷分别在2.16％～3.63%、0.0523%～0.1407%，其含量均达到《中国药典》及补充检验方法的限度规定（绿原酸不得低于1.5%、木犀草苷不得低于0.050%），与山东、河南主产区相当或略高。药材性状方面，金昌、徽县呈黄白色，而靖远呈黄绿色，皋兰呈浅绿色，这与产地采用的干燥方法（阴干、晒干或烘干等）不同有关。
金银花作为观赏植物在甘肃省内广为家种，作为药用资源是近几年从山东等地引种，虽然引种地区的地理环境差异较大，但由于金银花的生态适应性强，均取得了成功。金昌、靖远、皋兰种植于盐碱地，靖远、皋兰属于黄河流域，而徽县种植于山区，以上产区均符合金银花“以豫西山地、沂蒙山区及黄河故道区为重点建设金银花生产基地”的适宜区分析[6]。初步认为以上地区是金银花适宜种植地区，值得进一步加强种植技术研究，提高品质。甘肃其他地方仍可试验引种。
金银花原植物的种内变异很大，文献报道10种变异类型。在植物形态、绿原酸以及产量等方面有较明显的差异[3]。目前我国栽培的金银花品系较多，优良品种少，不少地方栽培面积较为分散；生产技术与加工不规范，故在引种时应考虑优良品种。同时，应进一步培育适合甘肃地方的不同经济用途的金银花品种。
金银花的品质受多种因素的影响，包括生长环境、栽培技术、采收季节、加工方法以及储存等，如生于阳坡金银花中的绿原酸高于阴坡；花朵不同发育阶段所含绿原酸不同，呈动态变化；储存的时间延长，绿原酸含量下降[3-4]；不同的加工方式对金银花的外观、气味等质量有明显的影响[5]（本文作者亦有研究，另文报道）。同时，甘肃由于气候地理影响，从陇南、定西、兰州、白银到金昌，花期从5月到7月，采期不同，因此，针对影响金银花品质的因素，甘肃各产区必须制定切实可行、可操作的金银花生产技术操作规程（SOP），以保证药材质量。
金银花是中医临床常用药材和药食兼用植物，已由单一药用向保健食品、饮料、日用化工等领域纵深发展。同时，世界天然药物需求量逐年以10％的速度增长，据中国经济林协会统计，2005年全国金银花年产量800万千克，而国内外市场需求量为2000万千克以上，供需缺口很大，金银花市场前景广阔。甘肃金银花基地应该建立“公司＋农户”生产加工的经营模式，带动广大农民致富。金银花含有的许多生理活性成分以及茎、叶还未得到充分利用，本省企业应与科研院所合作进行金银花综合利用研究。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典（2005年版一部及补充检验方法）[M].北京：化学工业出版社，2005:58.
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[3]黄西峰.金银花的研究概况及展望[J].中国中药杂志，1997，27（4）：247.
[4]王天志.金银花的研究进展[J].华西药学杂志，2000，15（4）：292.
1特征特性
亚特金银花，常绿小灌木，四季不落叶，直立多分枝，花期4—11月，每年开花4~5茬，花蕾密集于顶端，成熟整齐，便于采收。千针鲜重88.3g，果熟期11月下旬。平均株高为1.1m，平均冠径为1.2m，平均单株鲜针产量为1.01kg。五年生平均产干花1.50~2.25t/hm2，花蕾绿原酸含量为4.5%~6.3%，木犀草苷含量0.16%~0.25%；叶子绿原酸含量3.0%~3.5%，木犀草苷含量0.50%~0.85%。该品种抗逆性强，耐旱、耐涝、耐寒热、耐土壤瘠薄，抗病性强，易繁殖，根系发达。2004年通过山东省林业厅审定，2010年通过国家林业局审定（审定号：国S-SV-LJ-022-2010），适宜山东、安徽、湖北等省种植。亚特金银花的产量比普通金银花高3倍以上，产量优势十分显著，适合池州市大面积推广种植。
2高产栽培技术
2.1苗木繁殖
一是扦插繁殖。金银花生长季节均可进行扦插繁殖，以春、秋两季为好。选择无病虫害、生长旺盛植株一至二年生健壮枝条，截成长30cm左右的插条，每根至少具有3个节位，将下端切成斜口，摘下叶片，扎成小把，用生根剂IAA500mg/kg浸泡插口，趁新鲜进行扦插。挖穴扦插，每穴扦插3~5根，至少有1个芽节露在土面，地上留1/3的茎，踩紧压实，浇透水，30d左右即可生根发芽[1]。二是种子繁殖。秋季可随采随种，如果第2年春播，可用砂藏法处理种子越冬，春季开冻后再播。秋季种子成熟时采集成熟的果实，置于清水中揉搓，漂去杂质及果皮，捞出沉入水底的饱满种子，晾干贮藏备用。在苗床上开行距25cm宽的沟，将种子用35~40℃温水浸种24h后均匀撒入沟内，盖土厚3cm，压实，然后在畦面上盖1层薄稻草并浇水润土，10~15d出苗。播种量15.0~22.5kg/hm2。苗期要加强田间管理，当年秋季或第2年春季幼苗可定植于生产田。
2.2选地栽植
选择排水良好、土质疏松肥沃、周边无污染的地块种植，山地、荒坡、田野、林边、沟旁、房前屋后均可栽植。选用苗龄4~6个月、苗高30cm以上、茎粗0.6cm以上、抗逆性强、长势旺盛、根系发达、分枝2个以上、长势均匀、无病虫害、无畸形的实生苗或扦插苗均可。日平均温度稳定在8℃以上即可栽植。春、秋两季均可种植，以春季最佳，山区春季气温回暖较迟，宜在2月下旬至3月上旬栽植；秋植宜在10月上中旬的阴雨天进行。为提高土地利用率，减少管理成本，初期栽植，岗坡旱地株行距0.75m×1.50m，密度为8880穴/hm2，每穴定植1株。3年后移出1/2，株行距改为1.5m×1.5m，密度为4440穴/hm2；肥沃地初期栽植，株行距1.0m×1.5m，密度为6660穴/hm2，每穴定植1株，3年后移出1/2，株行距改为1.5m×2.0m，密度为3330穴/hm2。挖栽植穴，穴直径、深各30~40cm，坑内施经充分腐熟的有机肥10kg左右，与穴土拌匀。在种植坑中心开穴，每穴放置1株苗木。将根系摆好后填土，在填土过程中，分别将苗往上轻提，使根系伸展。切忌提得太高，提苗后把土压实，然后再往上填土，镇压，留树盘。淋透水，穴上盖草保湿。
2.3修枝整形
生长1~2年的金银花植株，植株枝条生长不规则，需要修枝整形。栽后1~2年内主要培育直立粗壮的主干[2]。当主干高度在30~40cm时，剪去顶梢。第2年春季萌发后，在主干上部选留粗壮枝条4~5个作为主枝，分2层着生，从主枝上长出的一级分枝中保留5~6对芽，剪去上部顶芽。以后再从一级分枝上长出的二级分枝中保留6~7对芽，再从二级分枝上长出的花枝中摘去勾状的嫩梢[3]。通过整形修剪的金银花，植株变成主干粗壮直立、通风透光、分布均匀、枝条分明的伞房形灌木状花墩，有利于花枝的形成，多长出花蕾。
2.4中耕除草
移栽成活后，为减少杂草对金银花生长的影响，每年要中耕除草2~3次，中耕时，在植株周围浅松土，要防止根系露出地面，并培土以保护植株，以免伤根，尤其是冬季[4]。3年以后，植株生长繁茂，可视杂草情况而定，减少中耕除草次数。
2.5肥水管理
根据金银花花期长的特点，一般花期4—11月，消耗养分较多，在栽培上除冬季重施有机肥45t/hm2，在春、夏、秋季现蕾开花期每月施速效肥（以三元复合肥和尿素为主）三元复合肥525kg/hm2、尿素150kg/hm2，冬春干旱季节要适时灌水，夏秋季阴雨天排涝。
2.6病虫害防治
金银花的主要病害有白粉病、褐斑病，对金银花叶片、花蕾的危害较大，通过修枝整形，改善通风条件，减少发病。药物防治，白粉病可用三唑酮800~1000倍液喷施，褐斑病用1.0∶1.5∶200.0的波尔多液在发病初期进行1~2次喷施。虫害主要有天牛、蚜虫等。天牛的幼虫蛀入木质化的茎杆危害茎基部至老茎枯死。发现成虫及时捕捉。可用药棉蘸80%敌百虫原液塞入蛀孔内防治。在产卵盛期用50%辛硫磷乳油600倍液灭杀[5]。蚜虫使花和花蕾卷缩，枝条停止发育，可喷施40%乐果乳剂800~1500倍液防治。
2.7采收加工
亚特金银花在移栽后第3年进入盛花期。一般在5月上中旬采摘第1茬花，隔30d后陆续采摘第2、3茬花[6]。采收期必须在花蕾尚未开放之前，当花蕾下部为青色、上部膨大、由绿变白、长3~5cm时采收为最佳。1d之内，以清晨至9：00前所采的花蕾质量最佳。采下的鲜花要及时干燥，采收金银花应选晴天早晨露水干后进行，可采用太阳晒或炭火烘或烘箱烘干等方式。降至常温后，装入干净无毒的塑料袋并扎紧袋口或其他盛具内贮藏，妥善保存待销。无论烘干或晒干，切忌停烘或用手翻动，未干之前切忌回潮。
3参考文献
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[4]靳武峰，李纪华，刘玉，等.金银花无公害丰产示范栽培技术[J].湖北林业科技，2011（4）：71-72，82.