分子生物学分析范文篇1

【关键词】传统方法；分子生物学方法；病原体

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.612文章编号：1004-7484（2013）-09-5287-02

传统的病原体分析方法为先进行分离培养，再通过其形态、理化特性、血清学反应等来进行鉴定，侧重病原体的表型特征；分子生物学方法从基因水平检测病原体专属保守或致病的核酸片段来间接指示病原体的存在或分型，侧重病原体的基因型。

首先，传统方法有它独特的优势——获得病原体的纯种。病原体的纯种可用于①全面了解其生物学特性，例如形态、染色、基因组、生化反应等特征；②了解病原体的致病物以及致病机制，例如用动物实验来进行检测；③预防性疫苗的研究，例如麻疹减毒活疫苗、甲型肝炎减毒活疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗、口服脊髓灰质炎减毒活疫苗、口服狂犬病减毒活疫苗等都是通过获得纯种病原体，通过特殊处理获得的；④治疗性药物及其耐药性的研究，分子生物学的方法可以检测其耐药基因，但欲准确掌握其耐药程度，必须依靠传统方法来进行测定；⑤建立分子生物学方法所用的数据库，PFGE、质粒图谱所用的数据库都是由分离得到的纯种所建立起来的。这些优势是分子生物学方法所不能替代的。

同时，传统方法又有其不足之处，在细菌培养中，营养要求高（血平板、巧克力平板）和需要特殊的培养条件（温度、pH、气体条件）细菌不易培养，麻风分枝杆菌无法人工培养；在病毒培养中，无敏感细胞（乙肝病毒）、不产生明显的CPE的病毒（披膜病毒）难于培养识别，尤其是对于新发疾病的病原体，其培养特性，形态特征，生化反应一无所知，此时必须借助分子生物学的方法，分子生物学基于基因型，无需分离到病原体，直接对标本进行检测。

两种方法各有侧重，各有优劣，下面主要就两个方法的特异度、敏感性、准确度等方面来进行评价。

1特异性

从特异性的角度来说，二者各有优势。分子生物学方法碱基互补配对的准确，目的基因的保守共同决定方法的特异性，例如在检测腺病毒时，采用了六邻体为其目的基因；传统方法从生物学特性的多角度，多方面进行鉴定，利用多个生化反应使最终的检测结果也指向唯一的病原，表型不如基因型稳定，但多角度的鉴定方法保证了单个变异不影响最终的结果，在对沙门菌的检测中，选择培养基，镜检特征，多项生化反应，血清学检验的多项检测结果均符合，才可判定为检出XX型沙门菌。

2敏感性

分子生物学的方法较为灵敏，如PCR能从100万个细胞中检出一个靶细胞，在病毒检测中，PCR的灵敏度可达3个空斑形成单位，在细菌学中最小检出量为3个细菌。同时也该看到其相对性，正因为分子生物学方法过于灵敏，标本中可能只是存在一段同源基因，而并非病原体，则会导致较高的假阳性率，且分子生物学方法立足基因，对于病原体的存活与否检测不出，目前已有文献显示先增菌再检测的方法或可改善这样的不足。

3准确度

传统的病原体分析方法分离培养至进行血清学鉴定只能确定病原体的血清型，这对于疾病诊断、治疗、指导用药来说已经足够，但对于流行病学调查却远远不足。追踪传染源、对病原体进行精细的型别鉴定、追溯病原的进化等这些工作传统方法无法完成；蛋白的非抗原性变异，血清学/免疫学方法均无法检出，分子生物学立足基因型，关注变异，对溯源工作的开展提供有力保障，而溯源对于疾病的预防和控制有重要意义。

超级淋球菌对治疗普通淋球菌的一线药物显示出抗药性，分子分型提示新型H041株与ST7393株相关，经过PFGE等三种分子生物学方法检测显示，H041株可能来源于ST7393株，具体的耐药机制仍需对基因进行进一步分析；H7N9疫情发生以来，卫生部门积极追踪传染源，绘制了编码H7、N9蛋白基因的进化树图，追踪到基因的起源，甚至对几个氨基酸位点的变异都可以进行准确的分析，突显了分子生物学方法的准确性。

4快速性

在突发公共卫生事件中，传统方法不能满足医院感染和流行病学的需要，及时的判定感染的爆发，确定传染源是控制流行和交叉感染的必要手段。

在对口蹄疫病毒的检测中，常规检测方法需采集标本、运输带回实验室进行检测，病毒分离费时，有的需数周时间，这些方法难于满足口岸动植物检疫部门及基层兽医检疫部门对进出口动物产品、痊愈动物带毒及亚临床感染的监测，RT-PCR检测仅需8小时，且对已知阳性样品检出率为100%，快速简便。但是也不可一概而论，对于PFGE等方法，需要48小时才可出现结果，故快速也是相对的。

分子生物学技术的快速还可用于初筛，与传统方法联合应用，为致病菌的检测提供新思路。

综上所述，单独一种方法都有明显的劣势和优势，所以，在实际工作中，需根据检测要求目的以及条件的限制选择合适的分析方法，对疾病的预防控制、检测及治疗都有重大意义。

参考文献

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分子生物学分析范文篇2

关键词动物科学专业；细胞分子生物学；实验教学改革；能力培养

中图分类号G642.0文献标识码A文章编号1007-5739（2017）11-0270-02

ExplorationonExperimentalTeachingReformofCellMolecularBiologyforAnimalScienceMajor

ZHAOJia-fu1，2DUANZhi-qiang1，2ZHANGYi-yu1，2NIMeng-meng1，2RUANYong1，2

（1KeyLaboratoryofAnimalGeneticsBreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegion，MinistryofEducation，GuiyangGuizhou550025；2CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity）

AbstractAsanessentialcourse，cellmolecularbiologyplaysanimportantroleinthetrainingofhigh-qualityinnovativetalentsinthefieldoflifescience.Alongwiththerapiddevelopmentoflifescience，moreandmoreattentiontothecultivationofstudents′abilitytooperateexperimentsneedtobeimproved，especiallyasanagriculturalsubjectwithextensiveapplication.Inordertoimprovestudents′interestinexperimentcourseofmolecularbiologyandpromotethestudents′abilityofexperimentoperation，thispaperdiscussedthereformofexperimentteachingcontent，experimentteachingmethods，teachingevaluationwaysofanimalscience，andputforwardtheconcretereformplan，basedontheexperimentalteachingexperiencesofcellmolecularbiology.Inconclusion，thisarticlehasimportantguidingsignificancetothecultivationofthestudents′practicalabilityandresearchquality.

Keywordsanimalsciencemajor；cellmolecularbiology；experimentalteachingreform；abilitytraining

细胞分子生物学是研究细胞内核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述它们之间相互作用的关系及基因表达调控机理的学科[1]，现已广泛应用于生物医学、农林牧渔等学科领域。我国是畜牧业生产和消费大国，需要大量基础理论扎实、创新实践能力强的畜牧科技人才。因此，重视畜牧兽医类本科生细胞分子生物学的理论与实践教学工作，引导学生发现问题、分析问题、解决问题，并进一步加强其动手能力和创新能力的培养，对培养畜牧兽医领域的复合型创新人才具有重要意义。动物科学专业作为生命科学领域一门实践性较强的学科，毕业生应具备牢固的专业理论知识和较强的实践动手能力[2]。以贵州大学为例，该校动物科学专业一直以来没有分子生物学这门基础课程，然而为培养学生基本的分子生物学实验操作能力，又区别于生物学相关专业，因而学校增加了细胞分子生物学这门课程供学生选修。P者结合具体实践教学经验，从实验教学内容、教学方法、组织形式、考核方式等方面进行论述。

1实验教学内容的改革

1.1增加实验教学课时比例

在贵州大学2016版动物科学专业培养方案中，与分子生物学实验相关的专业课程只有动物分子遗传学和细胞分子生物学2门课程。动物分子遗传学为专业个性选修课，占2学分，共36学时，其中理论课28学时，实验课8学时；细胞分子生物学为学科大类选修课，占4学分，其中理论课72学时，实验课时。从基本的课时设置上不难看出，细胞分子生物学实验课时与理论课时比例严重失调，许多重要的实验难以开设，培养学生分子生物学实践操作能力的效果大大折扣。因此，亟须调整本校动物科学专业教学方案，增加细胞分子生物学实验课时所占比例。

1.2编写适于动物科学专业的实验教学指导

目前，大部分高校细胞分子生物学课程均采用现成的实验教学指导，实验内容大同小异，并未体现出生物科学、生物技术、生物工程等理学类相关专业和动物科学、动物医学、水产养殖、草业科学等农学类相关专业在教学对象上的区别，均以大肠杆菌这类模式生物为实验对象，没有体现出不同专业研究对象的区别。因此，需要编写适合动物科学专业的细胞分子生物学实验教学指导，将动物组织中RNA的提取、不同组织中mRNA的表达差异检测、细胞中总蛋白的提取与分离鉴定等实用性、针对性强的实验编入教学指导。

1.3改单个实验为综合性设计实验

根据贵州大学动物科学专业细胞分子生物学培养方案中实验课时的规定，同时为加强贵州大学动物科学专业细胞分子生物学实验课程的针对性和实用性，目前该实验课程只能安排4个单个实验项目共时，分别是目的基因的扩增与连接、细胞的培养与冻存、细胞蛋白的提取与鉴定、细胞蛋白的免疫荧光染色。由于每节课只有2h，所以对于许多实验项目学生只能参与其中的部分内容，有些实验的来龙去脉很多学生还没有搞清楚。为达到开设这门课程的目的，尝试将单个实验全部设计为综合性实验，每个综合性实验融合了多个单个实验[3]，如猪GH基因原核表达载体的构建及表达、猪LPL基因的亚细胞定位研究、猪MSTN基因在不同组织的表达差异研究、猪APOA1基因在HEK-293T细胞中的免疫荧光检测、HEK-293T细胞总蛋白的提取、纯化与鉴定等综合性实验，这些实验学生只要参与完成其中一个项目，就基本上掌握了分子生物学的常用实验操作技能。

2实验教学方法的改革

2.1现有实验教学方法的弊端

一是教师课堂上讲授，学生到实验室验证，这种教学方式没有发挥学生的主观能动性，学生处于被动接受的状态，很难引起学生学习的积极性；二是教师准备好实验，学生只完成验证的那部分实验，这种方法无法培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，更难以培养学生基本实验的操作能力；三是针对部分实验，存在教师操作、学生观看的现象，如与细胞培养相关的实验，由于本科教学与研究生教学相比，参加实验人数多，易造成细胞室污染，所以很多实验都由任课教师亲自完成，学生基本上采用观摩的形式参与其中。以上教学方法上的弊端，严重影响了本专业学生实验动手能力的培养，不利于学生自身的发展。

2.2实验教学方法改革的具体方案

“翻转课堂”是一种新型的教学理念，最早由教育学者萨尔曼・汗创造性地提出，该模式提出了混合使用技术和亲自动手活动的教学环境[4]。它把传统的“灌输式”教学完全翻转，转变成学生课前预习、提前领会知识要点的教学方式，是一种强调自主性和针对性的教学理念[5-6]，对提高实验教学水平，培养出基础知识扎实、具有应用性和开拓性的创新型人才具有重要意义。为达到培养学生实践动手能力的目的，细胞分子生物学实验课程也引进“翻转课堂”的教学理念，转变师生角色，以学生为主体，发掘学生的个人潜力，培养学生的团队协作精神。按照“翻转课堂”的教学模式，在充分发挥学生主观能动性的前提下，制定细胞分子生物学实验教学方法改革具体方案。一是教师设计好综合性实验项目名称，提前供学生选择（至少10个综合性性实验项目名称）；二是按项目分组（每组7～10人），选出组长，分工进行资料查询、方案设计和PPT制作；三是每组20min进行PPT汇报，任课教师随堂对方案进行点评修改；四是参照实验方案开展研究，学生不必受实验课程时间的限制，在实验教师的参与下，根据各自时间安排完成整个实验项目；五是撰写实验项目报告，并写出个人体会和相关收获。

3实验教学考核方式的改革

3.1现有实验教学考核方式的弊端

以往的实验教学考核方式过于简单，且没有统一的标准，只注重是否来上课、是否交了实验报告、实验结果是否合理等方面，忽略了学生在发现问题、主动思考、团队协作、解决问题和语言表达等环节综合能力的考核。因此，实验教学考核方式的改革，应更重视学生综合运用所学知识分析问题和解决问题等方面能力的考察[7]。

3.2实验教学考核方式改革的具体方案

考核标准和考核方式对教师和学生都具有指挥棒的作用。考核什么、怎么考核直接影响到教师如何教、教什么和学生怎么学、学什么的问题。本实验课本着对学生发现问题、分析问题、解决问题及实验操作等方面能力的培养，特制定如下考核方案：按百分制，其中实验方案设计和PPT报告占40%，实验技能操作和实验报告占30%，实验技术提问和团队协作占20%，考勤和纪律占10%。这样的考核标准不仅可以公正、公平地衡量学生的实验成绩，更重要的是调动了学生学习的积极性和自主性，锻炼了学生发现问题、分析问题和解决问题的能力。

4结语

通过对动物科学专业细胞分子生物学实验内容、教学方法和考核方式的改革，进一步打破了实验教学与科学研究之间的界限，使学生能够根据自己的兴趣开展实验研究，充分体现了学生作为实验教学的主体地位，不仅锻炼了学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，还锻炼了学生实验操作、文献检索、PPT制作、团队协作及语言表达等方面的能力，达到了实验教学与科研素质培养的有机结合，为其今后从事相关研究工作或进一步深造奠定了坚实基础。

5参考文献

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[4]吴玲.融合翻转课堂理念教学凸显创新高效[N].中国教育报，2015-04-29（007）.

[5]王丽君，李萌，阳小华.翻转课堂中学习绩效提升研究[J].扬州大学学报（高教研究版），2016（2）：80-84.

分子生物学分析范文篇3

【关键词】sladr基因;湖南大围子猪;基因克隆;异种移植

cloningandbioinformaticsanalysisofsladrgenesinhunandaweizipigs

wangyan1,xingxiaowei1,xueliqun2,huangshengqiang2,wuxiaoli1,wangwei1*

1celltransplantation&genetherapycenter,thirdxiangyahospitalofcentralsouthuniversity,changsha410013;2departmentofanimalscienceandtechnology,hunanagricultureuniversity,changsha410128,china

[abstract]aim:toevaluatethepotentialofdaweizipigsasxenotransplantationdnorsfrompigstohumansbyanalyzingthecharacteristicsofsladrgenesinhunandaweizipigs.methods:sladraandsladrbgeneswereamplifiedbyrtpcr,clonedintopucmtvectors,sequencedandanalyzedthroughblastinncbiandrelatedsoftwareinexpasy.results:thesladraandsladrbgeneswere1177bpand909bpnucleotidesinlength,whichcontainopeningreadingframe(orf)andencode252and266aminoacidsrespectively.comparingthesladraandsladrbgeneswiththeircounterpartsequencesofhuman,thehomologiesofaminoacidsequenceswere82%and73%respectively.theaminoacidsinsladrαchainofdaweizipigsfromposition124to136,whichbindtohumancd4,showedonlytwodifferenceswithhladra:allevalchangeatposition127andaserthrchangeatposition136.theaminoacidsinsladrβchainofdaweizipigsfromposition134to148,whichbindtohumancd4,wereidenticalwithhladrb.furthercomparisonwithslasequencespublishedingenbankindicatedthatsladrbgenefoundindaweizipigshaspolymorphismwhilethehomologyofsladrageneisupto100%.conclusion:theclonedsladraandsladrbinhunandaweizipigshashighpolymorphismwithhladraandhladrbinhuman,indicatesthatdaweizipigshavesomeadvantagesasxenotransplantationdnorsfrompigstohumans.

[keywords]swineleukocyteantigendrallele(sladr);daweizipigs;genecloning;xenotransplantation

同种异体器官移植已成为治疗终末期器官衰竭的一种有效手段,猪被认为是异种移植最理想的供体来源[1]。然而,如何解决免疫排斥问题仍是阻碍临床大规模应用的主要问题之一[2]。猪的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,mhc),又称作猪白细胞抗原(swineleukocteantigen,sla),是由紧密连锁的高度多态基因座所组成的染色体的一个遗传区域,它作为主要组织抗原,参与移植排斥反应,是引起异种移植急性细胞性排斥的主要遗传因素[3]。通过对供体猪种进行筛查,尽可能选择与人类mhc同源性较高的猪种将有助于提高异种移植物在人体内的存活时间,为临床大规模开展将猪器官或细胞异种移植到人提供理想的供体猪种来源。

中国具有丰富的猪种种质资源,不同的地域分布形成了猪种的多样性和遗传的相对稳定性,为异种移植提供了可贵的研究和利用资源[4]。湖南大围子猪是我国特有的地方猪种之一,亦是湖南省著名地方优良猪种,具有繁殖力强、抗逆性强、耐粗饲、肉质好、生长慢、饲料效率高等种质性状。但是,大围子猪能否作为异种移植的供体,尤其是该猪种细胞表面sla特性如何,目前尚不清楚。本研究将克隆湖南大围子猪sladr基因,分析其sladra和sladrb基因特性,比较与人cd4分子结合部位大围子猪sladr编码氨基酸与人类相应dra、drb的同源性,为评价湖南大围子猪在异种移植中的应用前景,提供免疫学方面的依据。

1材料和方法

1.1材料总rna抽提试剂盒购自美国gentra公司;cdna第一链合成试剂盒购自fermentas公司;pucmt载体、引物、电泳试剂等购自上海生工生物工程技术服务有限公司;pcr高保真克隆酶easya购自stratagene公司;dnamarker(100bpladder)购自晶美生物工程公司;湖南大围子猪来自湖南望城大围子猪保种基地。

1.2方法

1.2.1湖南大围子猪sladra和sladrb基因引物设计根据genbank数据库中已登录的明尼苏达小型猪(minnesotaminiatureswine)的sladr序列(登录号为m93028,ab205163),采用pcrdesn软件设计以下引物。sladra:上游引物:5′ggcatctaaggagaaaatgac3′;下游引物:5′ccactcaaagtttattgtattcag3′,预计扩增片段大小为1177bp;sladrb:上游引物:5′ttgtcctctcctgttctccag3′;下游引物:5′taggacgcagagcatagcagg3′,预计扩增片段大小为909bp。

1.2.2rtpcr扩增湖南大围子猪sladra和sladrb基因在湖南大围子猪保种群中随机挑选两头个体,以700ml/l乙醇消毒耳尖取耳样组织,按rna抽提试剂盒(gentra公司)说明书方法提取总rna。测定每一样品总rna的浓度,模板定量为1μgrna,按revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit说明书方法逆转录合成cdna第一链。以合成的cdna为模板进行pcr扩增,20μlpcr反应体系中,分别加入下列物质:depc处理水13.5μl,pcr缓冲液2μl,25mmol/lmgcl21.6μl,10mmol/ldntp混合物0.5μl,50mmol/l上、下游引物各0.2μl,模板1.6μl,easya高保真酶0.4μl。在pe9700型pcr扩增仪上完成pcr扩增,扩增条件如下:先95℃预变性2min30s,94℃变性40s,58℃～59℃退火40s,72℃延伸40s,完成35个循环,最后72℃延伸5min,置4℃保温。取3.5μlpcr扩增产物,1.5g/l琼脂糖凝胶电泳,以鉴定pcr扩增结果。

1.2.3湖南大围子猪sladra和sladrb基因克隆与鉴定连接反应在10μl体系中进行:双蒸水3μl、pcr产物1μl、pucmt载体1μl混匀后加入5μlsolutionⅰ,16℃水浴连接过夜,转化感受态大肠杆菌jm109(采用cacl2法制备),4℃静置30min后放入42℃水浴中热休克90s,加入300μl预热的lb培养基,37℃下振荡培养(200r/min)45min,将菌液平铺于含氨苄青霉素的固体培养基上,37℃恒温箱中培养过夜。挑取单克隆,在含氨苄青霉素200mg/l的液体lb培养基中培养,以菌液为模板,pcr鉴定为阳性克隆,抽提质粒,送上海英骏生物技术有限公司双向测序。

1.2.4湖南大围子猪sladra和sladrb基因生物信息学分析用ncbihomepage中的orf对湖南大围子猪sladra和sladrb基因的开放阅读框进行识别;用expasy服务器中的prositescan软件对sladra和sladrb基因的功能域进行预测;用ncbi中的blast及expasy服务器中的clustalw等软件对获得的sladra和sladrb基因的序列结构进行比较分析。

2结果

2.1湖南大围子猪sladra和sladrb基因rtpcr扩增结果rtpcr扩增结果显示,两头湖南大围子猪sladra和sladrb均有特异性扩增条带,大小分别为1177bp和909bp,与预期扩增片段大小一致(图1)。

2.2湖南大围子猪sladra基因测序结果测序大围子猪sladra基因,结果表明:来源于两个不同个体的sladra基因序列是一致的,其cdna全长均为1177bp,包含一个759bp的完整的开放阅读框,推测编码252个氨基酸。生物信息分析发现,sladra第1～23位氨基酸为信号肽,第24～107位氨基酸为α1功能区,第108～202位氨基酸为α2功能区,第203～252位氨基酸为穿膜和胞浆功能区。推测sladra蛋白中有1个camp和cgmp依赖的蛋白激酶磷酸化位点,6个n肉蔻酰化位点,2个n糖基化位点,2个蛋白激酶c磷酸化位点,1个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点。

2.3湖南大围子猪sladrb测序结果测序大围子猪sladrb基因,结果表明:来源于两个不同个体的sladrb基因序列是一致的,其cdna全长为909bp,包含一个完整的开放阅读框,大小为801bp,推测编码266个氨基酸。生物信息分析发现,sladrb蛋白序列第1～29位氨基酸为信号肽,第30～123位氨基酸为α1功能区,第124～217位氨基酸为α2功能区,第218～266位氨基酸为穿膜和胞质功能区。推测sladrb蛋白包括3个n肉蔻酰化位点,1个n糖基化位点,3个蛋白激酶c磷酸化位点,1个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点。

2.4湖南大围子猪sladr与人类相应hladr同源性比较大围子猪sladra与人类的hladra(bc071659)相比较,在核苷酸水平同源性为88%,编码的氨基酸序列同源性为82%。sladrα链与人cd4分子结合部位介于第124至136位氨基酸,大围子猪sladra在此结合区域与人类相应的dra存在两个氨基酸差异,即:第127位(vallle),第136位(thrser)(图2)。

大围子猪sladrb与人类的hladrb*09012(ay622551)相比较,在核苷酸水平同源性为82%,编码的氨基酸序列同源性为73%。sladrβ链与人cd4分子结合部位位于第134至148位氨基酸,大围子猪sladrb在此结合区域与人类相应的drb相比氨基酸序列源性为100%(图3)。

2.5湖南大围子猪sladr基因与genbank里其它猪种序列同源性比较大围子猪与nih小型猪d单倍型(m93028)、湖南沙子岭猪(ef143987)sladra编码的氨基酸同源性为100%,与genbank里已发表的其它猪种的相应基因比较,同源性高达99%以上。大围子猪sladrb基因与genbank登录的许多猪种核苷酸和氨基酸序列同源性分别是93%～95%,89%～95%,并根据氨基酸比较结果建立种系进化树(图4)。

3讨论

免疫排斥反应仍是目前异种移植面临的最大难题,其中供受体组织相容性是研究异种移植排斥反应的关键问题。因此,组织相容性复合物即白细胞抗原是筛选供体时必须考虑的因素。异种猪抗原(主要是猪白细胞抗原sla)是引起异种移植t淋巴细胞介导的急性细胞性排斥反应的主要遗传因素[2]。sla被人t淋巴细胞识别存在直接识别和间接识别途径[3]。在直接识别途径中,猪slaⅱ类抗原经自身抗原提呈细胞(apc)处理,提呈给人cd4+t辅助细胞参与免疫排斥反应。人t细胞对猪异种抗原的间接识别是指猪的异种抗原以外源性蛋白质抗原的方式为人apc摄取、加工后,引起人特异性cd4+t细胞的激活与效应。在异种移植细胞性排斥反应中,异种抗原被人t细胞识别到底哪种识别途径占优势目前尚不清楚。andres等[5]认为在异种胰岛移植中,种系差异越小直接识别途径占优势,种系差异越大、间接识别途径占优势。因此,对slaⅱ类基因的深入研究将有助于猪人异种器官移植的供受体配型选择,有助于攻克异种移植排斥反应,筛选异种移植供体。

目前,国内外都积极致力于研究各猪种的sla,筛选异种移植供体,更好的为异种移植应用于临床服务。国外对yucatan小型猪[6]、westran猪[7]等,国内对中国西双版纳微型猪[8]、湖南沙子岭猪[9]、广西猪、贵州香猪、云南小耳猪[10,11]等猪种作为研究模型,通过克隆、测序分析sla基因,研究sla在异种移植排斥反应的发生机制中的作用。吴群等[12]对中国海南五指山猪进行研究,指出五指山猪种在与人类mhc遗传基因水平相似性方面有一定优势;在与人cd4相结合部位,五指山猪sladrb参与结合的关键氨基酸残基与人类完全相同,并且通过基因工程对五指山猪sladra分子两个不同的氨基酸残基进行必要的修饰和改造,使其成为理想的异种移植供体。

湖南大围子猪是湖南省著名的地方优良猪种,具有繁殖力强、抗逆性强、耐粗饲、肉质好、生长慢、饲料效率高等种质性状。本研究首次克隆湖南大围子猪的sladra和sladrb序列。sla位于猪的第七号染色体,由i类、ⅱ类和ⅲ类3个基因簇组成。slai类基因和slaⅲ类基位于7号染色体的短臂,slaⅱ类基因则位于染色体长臂上。研究表明:slaⅱ类抗原的基因主要有β链基因和α链基因两种,分别编码slai类抗原的β肽链和α肽链。编码slaⅱ类抗原β链的基因座sladr和sladq已被证明存在显著的等位基因多态性,而这种多态性与slaⅱ类抗原的生物学特性又是密切相关。生物信息分析发现,sladra基因为高度保守序列,各猪种间dra基因同源性高达99%以上,而sladrb基因在各猪种间具有丰富的多态性,这一结论与文献报道一致。

大围子猪sladra和sladrb与人类相应的dra、drb相比,氨基酸同源性分别为82%和73%。人cd4分子在排斥反应中发挥重要作用,sladrα链与人cd4分子结合部位介于第124～136位氨基酸,大围子猪sladra在该结合区域与人类相应的dra存在两个氨基酸差异,即:第127位(lleval),第136位(serthr);sladrβ链与人cd4分子结合部位位于第134至148位氨基酸,大围子猪sladrb在该结合区域与人类相应的drb相比氨基酸序列同源性为100%。该结果说明,湖南大围子猪sladr基因与人的相应基因组织相容性较好,可在异种移植排斥反应中以直接识别途径即人cd4+t细胞直接识别猪细胞表面的slaⅱ分子。

总之,通过本研究首次成功克隆了湖南大围子猪sladra和sladrb基因序列,发现该猪种与人类相应的dra和drb有高度同源性,在免疫学特性方面具有一定的优势,提示该猪种可作为异种移植侯选供体。

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