关键词：速灭威；单链抗体；噬菌体展示
中图分类号：Q819文献标识码：A文章编号：0439－8114（2011）09－1908-05
Construction，ScreeningandIdentificationofPhageScFvLibraryAgainstMetolcarb
LITie－jun1，LIDe－quan2
（1．ChemicalandBiologicalEngineeringInstitute，NantongVocationalCollege，Nantong226007，Jiangsu，China；
2．CollegeofLifeScience，LifeandScienceCollegeofNantongUniversity，Nantong226007，Jiangsu，China）
Abstract：Balb／CmicewereimmunizedwithahaptenconjugateofMetolcarb，andtheirspleencellswereharvested．VHandVLgeneswereamplifiedbyRT－PCR．VHandVLwerematchedintoScFcbyoverlapextensionPCR，andclonedintopCANTAB5Eexpressionvector，andthentransformedTG1cells．Thusthephagesingle－chainFv（ScFv）librarywithasizeofabout7．6×105wassuccessfullyconstructed．Thelibrarywasbiopannedby5roundsofbinding－elution－enrichmentprocedure；and6positivecloneswithhighspecificityforMetolcarbwereobtained．Theresultsgeneratedcouldbethefoundationforlarge－scaleproductionofspecificantibodiesagainstMetolcarb．
Keywords：metolcarb；singlechainFv（ScFv）；phage－display
速灭威（Metolcarb，3－甲苯基－N－甲基氨基甲酸酯）是氨基甲酸酯类杀虫剂，具有触杀和熏蒸作用，主要用于稻田、蔬菜、水果及经济作物等的害虫防治。虽然速灭威为中等毒杀虫剂，但农产品上残留的速灭威仍会对人体健康造成潜在的危害，有必要对其进行持续的监控检测［1］。
目前定量分析速灭威残留的主要方法是气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC）等仪器分析法，但这些方法必须对样品进行步骤冗长的纯化处理，很难达到快速、简便的现场检测要求；与仪器分析相比，免疫分析法具有快速、简单、灵敏、价廉等优点，可用于现场快速检测，具有广阔的应用前景和开发潜力［2］。
抗体作为免疫分析的核心试剂，其制备技术一直是制约免疫分析法在农药残留分析领域应用的瓶颈因素。与传统的多抗和单抗制备技术相比，第三代抗体制备技术――噬菌体抗体库技术具有基因型与表型相统一、选择与扩增相统一的优点，它不仅可以绕过繁琐的杂交瘤制备过程，甚至可以省略动物免疫的步骤，使得建立各种文库以及体外筛选任何目的分子的重组抗体成为可能［3］。因此，噬菌体抗体库技术为化学农药抗体的制备开拓了新的思路。
本研究利用噬菌体展示技术，构建抗速灭威噬菌体ScFv库，从中筛选与速灭威特异性结合的噬菌体ScFv阳性克隆，为进一步实现速灭威免疫快速检测提供大量制备特异性抗体的新途径。目前，国内外有关速灭威ScFv制备的研究尚未见报道。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1实验动物BALB／c小鼠，雌性，6周龄，由南通大学实验动物中心提供。
1．1．2主要试剂速灭威免疫原HOM－BSA和包被抗原HOM－OVA参照文献［2］的步骤合成；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；rTaqDNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自TaKaRa公司；mRNA纯化试剂盒、E．coliTG1、pCANTAB5E、M13KO7辅助噬菌体、ScFv构建试剂盒、重组噬菌体筛选试剂盒购自Pharmacia公司；蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；TMB（3，3′，5，5′－四甲基联苯胺）由中国华美生物工程公司进口分装；其余基本试剂均为分析纯。
1．2方法
1．2．1动物免疫及mRNA的分离免疫原HOM－BSA与等量弗氏完全佐剂混合，对小鼠腹腔注射进行免疫。换不完全佐剂，隔2周加强一次，共加强5次，取小鼠脾脏前3d再用HOM－BSA加强免疫一次，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检验抗体滴度，取免疫效果好的小鼠脾脏以Trizol试剂提取总RNA，经Oligo（dT）纤维素层析柱分离得mRNA。
1．2．2VH，VL基因扩增以mRNA为模板，在鼠源反转录酶催化下，以随机六聚体为引物合成cDNA第一链，用小鼠抗体重、轻链可变区特异性引物，PCR扩增VH和VL基因。将PCR产物进行1．5％琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。
1．2．3ScFv基因的克隆纯化回收的VH、VL基因片段与LinkerPrimerMix以等摩尔浓度混合，进行重叠延伸PCR反应。PCR反应参数为94℃、1min，63℃、4min，进行7个循环后延伸5min，从而将VH、VL基因随机拼接成ScFv，再继续进行30次循环，反应条件为94℃、1min，55℃、2min，72℃、2min，循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物进行1．5％琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。
1．2．4抗速灭威噬菌体ScFv库的构建将纯化的ScFv片段用SfiⅠ、NotⅠ双酶切，与经同种双酶预切的pCANTAB5E噬菌粒载体连接，转化感受态
E．coliTG1，铺板后，30℃过夜培养，计算重组子数，估计库容。随机挑取文库的重组子，提取质粒后PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后的ScFv基因片段用BstNⅠ酶切消化，4％琼脂糖凝胶电泳分析酶切指纹图谱，进行文库多样性分析，同时对提取的质粒进行HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定。其余菌落用2×YT液体培养基冲刮并收集，加入氨苄青霉素至105μg／L、葡萄糖至2％，并加入M13KO7辅助噬菌体超感染，37℃振荡培养1h后，离心沉淀菌体，用2×YT－AK液体培养基悬浮，37℃振荡培养过夜，离心沉淀菌体细胞，上清即为抗速灭威噬菌体ScFv库。
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1．2．5抗速灭威噬菌体ScFv库的富集筛选
1）第一轮富集筛选。参照文献［4］的步骤进行第一轮富集筛选。在进行第一轮筛选时，降低筛选强度可避免有价值的稀有噬菌体重组子的丢失。本研究第一轮包被抗原HOM－OVA的浓度为50.0μg／mL，噬菌体ScFv的非特异性洗脱次数为10次。筛选结束取10μL已感染重组噬菌体的细菌培养物作6次10倍稀释，100μL／SOBAG平板，30℃温箱培养过夜，测定噬菌体ScFv滴度，计算噬菌体的回收率，分析亲和富集效果。
2）后四轮富集筛选。第二、三、四、五轮筛选抗原的包被浓度依次为5．0、3．0、1．0、0．5μg／mL，第二轮以后的噬菌体ScFv的非特异性洗脱次数为20次，其余步骤同第一轮。
3）多克隆噬菌体ELISA。采用多克隆噬菌体ELISA分析各轮吸光度值变化可初步鉴定每轮富集筛选的效果。①将包被抗原HOM－OVA用0．05mol／L碳酸盐包被缓冲液（pH值为9．6）稀释为10μg／mL，96孔酶标板100μL／孔包被，4℃过夜；②去包被液，PBS缓冲液洗涤3次，3％脱脂奶粉（PBS缓冲液配置）200μL／孔，37℃封闭2h；③去封闭液，PBS缓冲液洗涤3次，每轮筛选后，分别取相同滴度（5×109PFU／mL）、PEG／NaCl沉淀获得的噬菌体ScFv与等体积3％的脱脂奶粉（PBS缓冲液配置）混匀，100μL／孔，37℃孵育2h，阴性对照为相同滴度扩建的原始噬菌体ScFv库；④去噬菌体悬液，以0．05％Tween20－PBS洗涤6次；酶标二抗HRP／Anti－M13用3％脱脂奶粉（PBS缓冲液配置）做1∶10000的稀释，100μL／孔，37℃孵育1h；⑤弃去溶液，以0．05％Tween20－PBS洗涤6次，加入TMB显色液100μL／孔，37℃孵育10min；⑥50μL2mol／LH2SO4／孔终止反应；⑦酶联仪测定OD450nm值。
4）单克隆噬菌体ELISA。随机挑选第三、四、五轮经PCR和酶切验证的重组子制备单克隆噬菌体ScFv；取相同滴度的单克隆噬菌体ScFv参照上述多克隆噬菌体ELISA步骤进行检测，阳性判定的标准为OD值大于等于阴性对照孔的2．1倍；通过计算每轮筛选的单克隆噬菌体ScFv的阳性率来鉴定富集筛选效率。
1．2．6高亲和力高特异性抗速灭威噬菌体ScFv的筛选
1）单克隆噬菌体ELISA筛选试验。①抗体库经五轮富集筛选后，将最后一轮筛选后的涂布在SOBAG平板上，分批挑选经PCR及酶切验证含重组噬菌粒的重组子制备单克隆噬菌体ScFv；②取相同滴度的噬菌体ScFv进行单克隆噬菌体ELISA筛选试验，阴性对照孔为相同滴度用空载体转化菌扩增的M13K07；③取ELISA吸光度值高的阳性克隆进行下一步竞争抑制试验，阳性判定的标准为OD值大于等于阴性对照孔的2．1倍。
2）竞争抑制试验。采用游离的速灭威原药进行单克隆噬菌体ELISA竞争抑制试验可进一步排除具高亲和力的非特异性阳性克隆。将50μL用3％脱脂奶粉（PBS缓冲液配置）稀释的噬菌体抗体（5×1010PFU／mL）与50μL不同浓度的（1、10、100μg／mL）速灭威原药（用3％脱脂奶粉10倍稀释）37℃孵育30min，使抗原抗体充分反应，其余操作同上述多克隆噬菌体ELISA；计算抑制率，分析竞争抑制效果。抑制率＝（未加速灭威的OD450nm－加入速灭威的OD450nm）／未加速灭威的OD450nm×100％。
2结果与分析
2．1抗体基因PCR产物的鉴定
用1．5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果显示扩增出的VH和VL基因片段分别约为340bp和320bp（图1），重叠延伸PCR后，获得扩增产物约为750bp的ScFv基因（图2），与预期的片段大小相符。
2．2抗速灭威噬菌体ScFv库的构建
ScFv基因片段经酶切、连接后，转化E．coliTG1感受态细胞。重组子在氨苄青霉素选择性培养基上生长旺盛，连接产物的载体转化率约为4．5×105／μg载体。为了增加抗体库容量，本研究将每40μL感受态细胞与4μL连接产物混匀后电转，共进行了40次连接和80次转化反应来构建抗速灭威噬菌体ScFv库。经计数，长出的重组子总数约为7．6×105，而以未转化的TG1感受态细胞涂布的平板则没有重组子长出。
2．3抗速灭威噬菌体ScFv库的鉴定
2．3．1重组子的PCR鉴定以随机挑选的重组子的质粒为模板，均能扩增出分子量大小约750bp的DNA片段（图3）。
2．3．2重组子的双酶切鉴定对PCR鉴定结果为阳性的重组噬菌粒进行HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示均被切成约2111bp和3111bp的两个条带（图4），表明有外源基因插入片段，连接转化成功。
2．3．3文库的多样性分析由于BstNⅠ的切割位点［5′－CC（A／T）GG－3′］在免疫球蛋白的可变区基因中大量的存在，因此可用BstNI酶切来间接鉴定文库的多样性［5］。本试验从文库中随机挑取的重组子的ScFv基因片段经BstNI酶切后的指纹谱型各不相同（图略），说明文库的多样性好、实际有效性有保障，该抗体库的库容量约7．6×105。
2．4抗速灭威噬菌体ScFv库的富集筛选
以速灭威人工抗原HOM－OVA对抗速灭威噬菌体ScFv库进行了5轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选。通过降低抗原包被浓度和增强洗脱力度的方法逐渐洗去了非特异性吸附的噬菌体ScFv。经测定，噬菌体第一、二、三、四、五轮的回收率分别为1．0×10－4％、1．1×10－5％、2．6×10－4％、5．9×10－4％、5．6×10－4％，总体上显示了一个增加的趋势，说明特异性的噬菌体ScFv得到了有效富集。
2．5富集筛选效果的分析鉴定
2．5．1多克隆噬菌体ELISA的初步分析5轮洗脱液扩增的噬菌体ScFv各取5×109PFU／mL进行多克隆噬菌体ELISA检测，其OD450nm值逐轮增高，分别为第一轮0．107±0．010、第二轮0．143±0．020、第三轮0．282±0．020、第四轮0．431±0．010、第五轮0．533±0．020，而阴性对照（原库扩增产物）OD450nm值为0．076±0．010。结果显示，从第三轮开始，OD450nm值已为阴性对照的2．1倍以上，说明各轮富集筛选有效。
2．5．2重组子的PCR鉴定经过对第三、四、五轮富集筛选后SOBAG平板菌的菌落PCR鉴定，每轮随机挑选的20个重组子均能扩增出大小约750bp的片段（图略），不存在插入子片段缺失的现象。
2．5．3重组子的双酶切鉴定选PCR鉴定结果为阳性的噬菌粒进行HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示均被切成约2111bp和3111bp两个条带（图略），证明富集筛选过程中插入的ScFv片段没有丢失。
2．5．4筛选效率的比较对上述第三、四、五各轮随机挑选的20个经PCR和酶切鉴定的重组子进行单克隆噬菌体ELISA检测，结果显示，第三、四、五轮的阳性率分别为35％、65％、80％，第三、四、五轮的P／N均值分别为2．32、3．21、4．41，说明本试验富集筛选效率较高。
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2．6单克隆噬菌体ELISA筛选高亲和力阳性克隆
从第五轮筛选后得到的细菌集落中分批随机挑选大量重组子，以未经筛选的噬菌体初级库为对照，单克隆噬菌体ELISA测定这些重组子的噬菌体ScFv与HOM－OVA的结合活性，从中筛选出20个P／N值达到4．00以上的高亲和力阳性克隆。
2．7阳性克隆竞争抑制试验结果
为了排除假阳性发生，对上述20个阳性克隆进行竞争抑制反应，竞争抑制结果显示：当抗原包被浓度为5.0μg／mL、噬菌体滴度为5×1010PFU／mL时，有6个阳性克隆对速灭威的识别作用明显（表1），竞争抑制反应体系中速灭威浓度为10μg／mL时，抑制率均达到20％以上。
3讨论
抗速灭威噬菌体ScFv库的多样性是获得特异性噬菌体ScFv及分泌表达单链抗体的关键所在。为了能最大限度地获得抗体可变区基因，保持文库的多样性，我们采取了以下措施：①扩增小鼠重链、轻链基因时采用的PCR引物套组是根据抗体可变区基因上、下游相对保守的骨架区设计的，理论上该套引物能结合数百个V片段中的任何一个以及6个J片段中的任何一个，有较好的通用性，可确保ScFv文库能最大限度地保持小鼠体内B细胞克隆的多样性，这是保证抗体库容量的基础［6］。②在试验中加大了VH、VL的原始用量（由cDNA扩增得到的VH、VL）；尽管操作手册建议用PCR产物再扩增，但扩增后仅仅增加了基因的量，抗体库中基因的多样性并没有增加；因此研究中我们采用了混合多次、由cDNA直接扩增得到的VH、VLPCR产物的方法来保证其所用量。BstNI酶切指纹图谱分析表明，本研究所构建的免疫抗体库具有良好的多样性分布，库容量为7．6×105。
噬菌体ScFv库的筛选，需要对许多条件进行优化，包括噬菌体的制备及其滴度，但更重要的是要优化筛选策略。本研究我们通过降低抗原浓度、增强洗脱力度的方法逐渐富集与之特异性高亲和力高的噬菌体。①利用抗原浓度递减的梯度式筛选。因为第一轮淘选时，阳性克隆在抗体库中的比例和数量很低，若选择强度过高，极易导致阳性克隆的丢失，且在后几轮的淘选中将无法弥补。经过第一轮的淘选后，阳性克隆获得了一次富集和扩增，数量和比例均得以大幅度提升，因此在随后的淘选中，即使提谨度，阳性克隆也不易丢失。②确定筛选轮数。筛选轮数过少，特异性噬菌体ScFv不能高度富集，筛选轮数过多，产出率会降低。有研究证明，重复5次筛选效果较好［7，8］。本研究为了得到特异性高的噬菌体抗体，共经过了5轮严格的“吸附-洗脱-扩增”淘洗过程。③确定洗涤次数。本研究第一轮筛选洗涤10次，可将非特异性噬菌体和辅助噬菌体洗去，第二轮以后洗涤20次，可除去亲合力低的噬菌体ScFv，得到高亲合力的噬菌体ScFv。噬菌体回收率及ELISA鉴定结果显示，上述筛选策略是较为成功的。
本研究通过5轮“吸附-洗脱-扩增”的过程，观察到了特异性噬菌体ScFv的富集，但是，富集程度与国外文献报道的相比有一定的差距，筛选出的阳性克隆比例亦低于文献报道［9］。分析原因可能为：用单一纯化抗原免疫小鼠构建的文库通用性差、容量偏小，B细胞中原始的重轻链之间的组配（Pairing）可能发生了丢失。理论研究表明文库容量越大筛选任意抗原表位的抗体的机率就越大，发现高亲合力噬菌体ScFv的可能性也会有所增加［10－12］。诚然，经过一系列的筛选虽然获得了6个有一定特异性的噬菌体ScFv，但我们应该看到这些阳性克隆的亲和活性仅仅是分泌型噬菌体ScFv所表现的活性，而且，噬菌体外壳蛋白对ScFv的活性还存在一定的影响，因此，关于这些阳性克隆的应用前景仍有待于对可溶性ScFv特性的进一步研究加以验证。
4结论
本研究以速灭威抗原免疫的小鼠为试验对象，成功构建了库容约7．6×105的抗速灭威噬菌体ScFv库，通过对该文库的5轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得了6个特异性较强的抗速灭威噬菌体ScFv阳性克隆。本研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础，对开发其他化学农药的重组抗体具有重要的理论价值和实践意义。
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下图是生态系统中碳循环的简明示意图，请据图作答：（11分）（1）图中缺少的一个重要箭头是___________。（也可以在图中标出。）（2）A过程是_________的_________作用。（3）与A过程本质相同的有__________过程。（用图中字母代号表示。）（4）碳在无机环境中主要以_________、________、_______形式存在，而在无机环境与生物之间以_______形式进行循环。碳循环始终与__________结合在一起进行。（5）生态系统的各种成分是通过________和_________紧密联系在一起而形成一个统一的整体。6．我国南方某些地区建立了“桑基鱼塘”农业生态系统，获得了鱼、猪、蚕和粮的全面丰收。如图是该生态系统各要素之间关系示意图，请据图作答：（16分）（1）该生态系统所需的能量来自___________。（2）该生态系统的生产者是___________。（3）该生态系统中除了已知的生物种类外，还必须有__________、__________等生物作为_________。（4）在该生态系统内，人们合理地调整生态系统中__________的关系，使能量持续高效地流向对____________最有益的部分。（5）该生态系统是根据__________的原理建立的。7．在生态系统中，组成生物体的化学元素从________开始，经_________、________和_________，又回到________，就完成了一个循环过程，我们称之为生态系统的________。（6分）8．如图是处于平衡状态的某草原生态系统的食物网。请据图作答：（12分）（1）图中鼠与兔之间构成了__________的种间关系。（2）从进化角度看，鹿奔跑速度会越来越快。鹿奔跑速度的提高是通过_________之间的生存斗争来实现的。鹿群个体问在奔跑速度上的___________为鹿的进化提高了选择材料，而定向的_________决定了鹿的进化方向。（3）本食物网中猫头鹰占有__________个营养级。（4）由于人们连续地围猎狼，___________大量繁殖，结果草原植物受到破坏。停止围捕几年后，狼的数量逐渐增多，该生态系统又恢复平衡。这说明生态系统具有_________能力。
在一杯温开水中加入一大勺糖和一小包酵母，进行搅拌，倒人玻璃瓶内，再往瓶内加一些开水，将一个气球挤瘪后套在瓶El，将瓶放在温暖的地方，每天观察。（10分）（1）你所观察到的现象是____________________________________________________。（2）如果观察到气球膨大，你认为气球内的气体是_________。（3）这里的酵母是指__________。（4）你认为酵母菌的生活方式是____________________________。（5）上述酵母可用于制作的食品是（）。A．馒头、面包B．酱C．酸奶D．豆腐乳10．有一学生学过食品保存一节后到一连锁超市去调查，他看到的食品有：冰柜内的汤圆，牛肉干、熏肠、苹果罐头、纯鲜牛奶、冻鱼、杏脯、咸肉、火腿、熏鱼，请你与他一起对上述食品的防腐方法进行分析说明：（10分）（1）不论哪一种方法都是________细菌、真菌在食品中的_________，达到防腐目的。（2）汤圆和冻鱼使用的防腐方法是___________________________________________。（3）牛肉干使用的防腐方法是_______________________________________________。（4）苹果罐头、纯牛奶使用的防腐方法是_____________________________________。（5）杏脯、咸肉使用的防腐方法是___________________________________________。（6）火腿使用的防腐方法是________________________________________________。（7）熏鱼、熏肠是用火熏制，使食品中减少_________，并在食品表面形成一层防腐剂，达到防腐目的。（8）在上述防腐条件下食品是不是可以永久保存?_____________。为什么?___________。11．酸牛奶是营养丰富的饮品，其主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖类、无机盐等。请根据所提供的材料和用具设计一个简易的方法，用于家庭制作酸牛奶。（8分）（1）材料用具：①酸牛奶、市售鲜牛奶；②洁净的奶瓶若干；③盛水器皿（如盒子）；④温度计简答题（共60分）1．基因工程是在________上进行的_________操作。按照预先设计好的蓝图，把一种生物的_________分离出来，在________巧妙地进行________，然后_______另一种生物的体内，从而改造其某些________，最终获得我们所需要的________。这种含有非自身基因的生物被称为_________。（9分）2．克隆是指生物体通过__________进行的__________。（2分）3．利用克隆技术，可以快速地培育具有__________和__________，也可以将_________动物大量繁殖，还为拯救_________动物开辟了一条新途径。（4分）4．基因工程技术对人类产生的影响有积极的一面，同时也存在着很多需要继续探讨和解决的问题，这些问题主要表现为_______________________________________。（4分）5．“不打农药可抗虫，少吃化肥也长壮，仅用雨水照样活”的“绿色超级稻”你听说过吗?作为全球水稻的生产和消费大国，中国是世界上使用农药和化肥最多的国家，而水稻用水占了全国总耗水量的一半以上。残留的农药最终进入人们的食品，长期使用化肥使土壤板结，耗水量不断增加等等，使农田生态系统遭到严重破坏。中国科学家启动了“全球水稻分子育种计划”，建立了世界上的水稻基因数据库。科学家们研究每个基因的作用，进而培育出高产抗病的“超级水稻”。2008年，上海科学家培育出的节水抗旱的“绿色超级稻”已经在全国一些地区推广种植。（14分）（1）作为餐桌上的主食，大米的营养储存于水稻种子结构的_________中。（2）施用化肥能提高水稻产量，因为化肥为水稻的生长提供（）。A．无机盐B．有机物（3）“残留的农药最终进入人们的食品。”这说明有毒物质会随着食物链积累，最终将危害_________的健康。（4）大量使用化肥和农药“使农田生态系统遭到严重破坏”，这说明生态系统的________能力是有限的。（5）科学家利用水稻基因数据库培育多品种水稻，实际上这是________多样性在农业生产上的应用。（6）你认为“绿色超级稻”的推广种植对环境保护有什么积极意义?6．下图是克隆羊“多莉”的培育过程，请分析作答：（12分）（1）“多莉”的产生没有经过精子和卵细胞的结合，而只以含有甲羊细胞核的体细胞培育而成，这种生物技术叫_________。（2）“多莉”的遗传物质与________绵羊相同，这说明________对“多莉”的外形长相起决定作用。（3）对克隆人类你持什么观点?简述理由：_________________________________。
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关键词学科优势生命伦理教育初中生物学教材
中图分类号G633.91文献标识码B
生命伦理学起源于20世纪60年代的美国，是迄今为止世界上发展最迅速、最有生命力的交叉学科。生命伦理学中的生命主要是指人类生命，但也包括动、植物生命乃至生态系统;伦理学是用道德价值和原则对生命领域中人类行为的规范性进行检验。因此，生命伦理学具有生命科学与哲学双重身份。
在我国，生命伦理学起步较晚，很多人对它还很陌生。虽然诸如医学、生物学等相关专业的生命伦理教育有一定的存在规模与发展，但是在中学中，系统的生命伦理教育尚处萌芽状态。中学阶段是学生形成世界观、人生观、价值观的关键时期，初中生正处于活力四射的青春期，他们思维活跃，易接受新鲜事物。因此，初中阶段无疑是学生伦理意识开始形成并逐渐成熟的重要时期。在初中阶段的各学科中，又以生物学科最有可能也最有利于渗透生命伦理教育，作为基础教育中的生物学教育，应当担当起进行生命伦理教育的重任。生物学教师应充分发挥自身学科的优势，利用生命科学的丰富资源，结合学生实际，切实有效地开展生命伦理观的教育。下面以北师大“新世纪”（版）初中《生物学》（以下简称北师大版）八年级教材为例，谈谈如何发挥学科优势渗透生命伦理教育。
1挖掘初中生物课程中的相关教学内容，让课堂焕发出生命活力
在传统教材中，学生更注重的是理解科学知识，忽略了对生命的思考。新课程标准十分注重科学精神和人文精神的统一。北师大版初中《生物学》教材比较全面地讲述了生物学各领域的基础知识，在生命伦理教育方面，并不是纯粹传授生命伦理知识，而是注重增强学生的生命伦理思辨能力，有助于提高学生的生命伦理道德水准，体现了人文关怀的思想。八年级教材中生命伦理教育的内容主要有以下几个方面。
1.1培养学生热爱生命、珍惜生命的情感
北师大版教材第19章专题阐述了生物的生殖和发育这一有关生命延续的基本特征。“我从哪里来”是学生小时候最感兴趣的问题之一，他们渴望了解自己的出生之谜。所以，本章教材在第1节首先讲述人的生殖和发育。“新生命的孕育”这部分内容让学生认识到人的由来，从而理解每个人都是世界上独一无二、最优秀的个体。生命来之不易，非常珍贵，值得人们去珍视、善待。此外，本节教材的“小资料”介绍了人体受精、早孕危害、避孕等性知识，有利于帮助学生健康地度过青春期。第19章第3节呈现的内容是植物的生殖方式。学生通过学习绿色开花植物的繁殖过程，懂得被子植物的繁殖要经过开花、传粉、受精的过程，才能结出果实、产生种子来繁殖后代，任何一个环节出现问题，如花的雌雄蕊受伤或未传粉，就无法形成种子。学生初步感受到生命的可贵，才能珍爱、珍惜生命。教师可以利用这些知识让学生体会到生命在大自然中孕育与生存的不易，引导学生去体会生命从开始孕育到最终诞生的艰难过程，进而培养学生热爱生命、珍惜生命的人文情怀。
1.2利用生态学知识，进行生态伦理教育
教材基于对生命伦理的广义理解，在第23章“生态系统及其稳定性”中，渗透了着生态伦理、环境伦理教育。第23章第4节提供了一份资料：位于北美的凯巴森林，原本是一片和谐安详的景象，印第安人和各种生物在这片森林中和谐地生活着。后来，凯巴森林被列为国家禁猎区，政府严禁在林区内捕杀黑尾鹿，却允许猎人捕杀以黑尾鹿为食的野兽。30年后，凯巴森林失去了往日的宁静，面目全非。学生通过寻找凯巴森林变迁的原因，对生态系统稳定性和有限的自我调节能力进行了分析。正是由于人类的不恰当干预打破了凯巴森林的安宁，使得森林生态系统的稳定性受到破坏，然后进一步分析生态失衡的其他因素，主要原因是人类对自然资源进行掠夺性开发，如森林被砍伐，草场遭破坏，导致土地荒漠化，从而造成全球性生态环境急剧恶化，地球所能维持人类生存的能力正在衰减。愈演愈烈的环境问题必须要引起人类足够的重视，由此教师要增强学生的环保意识，理解人与自然和谐发展的意义。
1.3正确的认识和应用生物技术才能为人类造福
随着科学水平的飞速发展，现代生物技术在向人们展现美好未来的同时，也给人们带来了很多伦理难题。例如人类已经可以根据自己的意愿利用基因工程改造生物的性状，甚至培养出自然界中并不存在的物种。大量的人工培育会不会影响物种的发展？是否允许人们通过改变基因来选择自己喜欢的的性状，甚至根据自身愿望来选择未出世孩子的特征？……这些问题都促使教师在教学中需要对学生进行生命伦理教育。
现代生物技术种类繁多，原理复杂，对于初中生来说，难度较大。因此，第25章“生物技术”仅选择转基因技术和克隆技术。“克隆技术”部分的教材内容从“寻找科学家培育克隆羊‘多莉’成功的奥秘”的活动入手，使学生对克隆技术有所了解，接着阐述了克隆技术的应用意义，但克隆技术引起的伦理之争是存在的事实，如克隆哺乳动物家族的日益壮大让“克隆人”成为人们热议的话题。教师也可以就此让学生展开讨论：“你赞同克隆人吗？为什么？”这些道德评判对于培养学生面对生命伦理的独立思考、形成自己对生命伦理的独到见解大有裨益。
2在教学中培养学生生命伦理观念的方法
北师大版初中《生物学》教材中的生命伦理道德教育的内容呈现形式多种多样，有助于教学形式的多样化。教师可采取讲解、讨论、实践活动、角色扮演等多种方式进行教学，不仅使学生在接受生命伦理教育时不会感到枯燥和乏味，还可突出学生的主体性，让学生在参与的过程中自然融入伦理冲突，做出自己的价值判断。
2.1课堂教学是进行生命伦理教育的主渠道
生命伦理教育的教学过程不单纯是传授知识的过程，更倾向于塑造人格的过程。因此，教师在授课过程中，在让学生了解有关生命科学知识的同时，引导学生进行课堂讨论，是道德观念培养和形成较好的途径和办法。如第25章第2节介绍了转基因产品带给人们巨大的利益，同时又质疑“转基因食品是否会引起中毒或过敏反应，转基因生物或其他产品对其他生物或生态环境是否构成潜在的不利影响”，要求学生就此问题发表自己的观点，使学生懂得现代生物技术手段带来的利害得失需要权衡，有利于学生对生命伦理的认识逐步趋于规范和理性。
2.2联系生物学知识、积极开展课外实践活动是进行生命伦理教育的良好途径
课外实践活动让学生在活动过程中不断地思考并获得亲身的感悟。生命的成长需要生命本身的体验，才是真正意义上的获得，只有亲身体验的东西，才是真正意义上的获得。例如，在学完“植物的生殖方式”一节之后，笔者利用我校科技活动时间组织学生培育植物来体验生命的历程。当学生看到自己亲手播种、施肥和精心呵护的植物由小长大直至开花结果时，他们不仅取得收获满怀欣喜，更在这个过程中知晓了生命的萌芽、发育、成长的不易，感受生命受损的痛苦，从而推物及人，敬爱生命之情油然而生。
2.3拓展其他方式让生命伦理教育更丰富
教材并不是通过简单说教进行生命伦理教育，安排了许多建议活动促使学生透视生命、理解生命、尊重生命。如“写科幻文章――假如地球上没有微生物”、“参加爱鸟周活动”、“角色扮演――研讨动物与人类的关系”等。教材还提供了不少小资料和课外读，拓宽了学生的视野，更新了学生的观念。如“慎用抗生素”、“早孕的危害”促使学生善待自己、善待他人;“远渡重洋的屎壳郎”、“加强农药的环境监督刻不容缓”等有利于学生生态伦理观的构建。这些建议活动和课外阅读内容都能提高学生对生命本质的认识和理解。另外，还可以通过举办知识讲座、知识竞赛、图片展览等活动进行生命伦理观的教育。
3结语
独立开设生命伦理学课程对于培养学生的伦理观念最有利，但就我国目前初中的教育教学现状来看，在绝大部分学校中还做不到。因此，生物教师结合生物学教材内容，将生命伦理学的观念自然地渗透给学生是比较切合实际的做法。北师大版初中《生物学》教材具有很大的灵活性和弹性，教师可以针对本地区、本校状况和初中生的年龄特征和知识水平进行课程的再建设，挖掘出更多初中生感兴趣、乐于接受并且能充分调动其主观能动性和动手能力的课程呈现形式，对学生的生命发展给予及时、必要的指导和关怀，把自然科学和人文科学、哲学很好地结合起来在新课程中实施生命伦理教育，对于学生的成长具有很好的效果。
参考文献：